[KSS17]

Здравствуйте!
Думаю, здесь будет самое место для статеек по пробоподготовке в ХТ и СХ анализе.

Обзор по твердофазой микроэкстракции (ТФМЭ)
Недавние события в разработках технологии твердофазой микроэкстракции и её применения в приложении к пищевой промышленности, окружающей среде и биоаналитической химии.
Кратко представлена историческая перспектива от самых ранних работ, связанных с развитием теоретических принципов ТФМЭ. Особое внимание сделано на самые последние разработки в области автоматизации, высокой пропускной способности анализа, методы оптимизации ТФМЭ, подходы и строительство новых устройств ТФМЭ и их применения.
Язык, как понимаем, английский…

Сообщение отредактировал KSS17 - 25.10.2009 - 11:46

[Гермиона]

Здравствуйте, коллеги!
Имеет смысл продолжить тему пробоподготовки.
Вариантов извлечения искомых соединений из биологического материала немало, но многие из нас, мягко говоря, "не все знают".
Например, слышала о применении в ходе пробоподготовки замораживания образцов вместе с органической фазой, но нигде не встречала в литературе. Или не там искала.
Помогите, пожалуйста, если кто применяет этот метод.

[chemist-sib]

Доброго времени суток, коллега Гермиона. Вроде бы, была в СМЭ статья (и, вроде бы, сочинских химиков) про экстракцию производных 1,4-бензодиазепина из мочи вымораживанием. Пытаюсь сейчас ее найти; может, кто из коллег быстрее это сможет сделать?
ЗЫ: вот, наконец-то (конкретно там про оксазепам и феназепам):
Бехтерев В.Н., Гаврилова С.Н., Маслаков И.В. Использование экстракционного вымораживания для анализа 1,4-бензодиазепинов в моче. – Суд.-мед. эксперт.-2007.-№ 2.-С.32-35. Список лит.: С.35 (6 названий).
ЗЫЗЫ: но сам, своими руками, не повторял.

[sch1sm]

Здравствуйте, коллеги!
Имеет смысл продолжить тему пробоподготовки.
Вариантов извлечения искомых соединений из биологического материала немало, но многие из нас, мягко говоря, "не все знают".
Например, слышала о применении в ходе пробоподготовки замораживания образцов вместе с органической фазой, но нигде не встречала в литературе. Или не там искала.
Помогите, пожалуйста, если кто применяет этот метод.

вот тут статья небольшая, Пермская государственная фармацевтическая академия написала.
кое что пытаюсь сейчас повторить из статей, но хвалиться пока особо не чем(мало наработал материала)

Сообщение отредактировал sch1sm - 14.12.2013 - 13:37

[Deminolog]

Есть такой подход, называется "экстракционное вымораживание". Несколько лет назад на эту тему (ну, не только на эту, но и она затрагивалась) была защита докторской диссертации в МГУ, защищался Бехтерев Виктор Николаевич, г. Сочи, специальность 02.00.02 - аналитическая химия... Если загуглить - сразу попадаете на ссылку на патент об экстракционном вымораживании карбоновых кислот (по-моему).
Данный подход очень хорош и удобен тем, что, фактически, повышает эффективность ЖЖЭ. Это, можно сказать, модификация. При понижении температуры растворимость в воде у некоторых соединений падает и они сначала переход на границу раздела фаз, а при замерзании воды - переход в органический слой, хотя в н.у. этого бы не произошло.
При анализе НС и ПВ, в частности, удобно применять следующий способ: провести гидролиз (например, ферментативный), после чего добавить буру для того, чтобы довести рН до 9-10 (или же просто добавить аммиак), безводный сульфат натрия (или любой другой высаливатель), перемешать тщательно, добавить органический растворитель (например, диэтиловый эфир, который легко будет потом отогнать или упарить). Поставить на встряхиватель, чтобы добиться хорошего перемешивания. Спустя какое-то время пробы центрифугируются и ставятся либо в морозилку, либо в криотермостат. После того, как водный слой замерзнет, аккуратно перенести органический слой в отдельную посуду (пробирку). Эфирный слой легко улетит при температуре 45-50 градусов, при этом практически не будет потери аналита. После упаривания можно реконструировать экстракт в любом удобном растворителе, провести дериватизацию... В общем, все зависит от того, какой метод для анализа Вы планируете использовать дальше.
Относительно ТФЭ и микроТФЭ.
Существуют разные системы для проведения подобных экспериментов: манифолды положительного давления и вакуумные манифолды. Автоматизированные системы ТФЭ, на сегодняшний день, не получили (да и не получат) массового распространения в виду своей громоздкости и стоимости, хотя они иногда бывают очень удобны.
Существуют также системы on-line SPE, когда патрон подключается в систему ВЭЖХ. Есть headspace, когда сорбируют на волокно в шприце, а потом десорбируют в инжектор ГХ. Эти системы активно развиваются и, думаю, будущее за ними.
Но вернемся к более простым, понятным и, я бы сказал, удобным системам. Это системы с вакуумным манифолдом и манифолдом положительного давления. Вакуумный манифолд удобен тем, что он универсален. В идеале, вакуумный манифолд должен быть укомплектован еще кранами для регуляции скорости потока, проходящего через патрон. Тогда эта система становится незаменимым помощником для Вас. Без этих кранов Вы увидите, что скорость каплепадения слишком велика (если только насос не позволит регулировать разряжение), а значит легко может произойти проскок аналита. Более того, каплепадение возле крана, подключаемого к насосу, будет сильнее. Отсюда вытекает главный недостаток вакуумных систем - неравномерность.
Манифолд положительного давления питается либо воздухом, либо азотом, подаваемым либо компрессором, либо генератором. Удобная штука. Давит равномерно, если уплотнение наклеено верно. Удобно сушить патроны для элюирования органикой и последующей дериватизации. Недостатки - для работы с микроТФЭ придется покупать отдельный манифолд на 96 позиций (маленькие патрончики не встанут), а для всех остальных - манифолд на 48 позиций с разными держателями под разные формы патронов. Кроме того, манифолды положительного давления стоят намного дороже.
Сейчас стали очень популярны так называемые well-plate. Плашки для микроТФЭ на 96 образцов.
Сорбентов для ТФЭ - великое множество. Также набирают популярность ионно-обменные сорбенты, работающие по смешанному механизму удерживания, сорбенты на основе дивинилбензола, который, кстати, широко используется при получении монолитных колонок для ВЭЖХ...
Вот как-то так... Простите за лекцию, просто недавно небольшой обзорчик писал, тоже этот вопрос поднимал :-) Если что - готов обсудить какие-то моменты подробнее...

Сообщение отредактировал Deminolog - 14.12.2013 - 15:00

[Гермиона]

Здравствуйте, коллеги!
Благодарю за подробные ответы. Честно говоря, думала вначале, что вымораживание применяют в каких-то частных методиках. Обязательно буду пробовать в рутине, если выход НС окажется ощутимо выше, введу в пробоподготовку дополнительный пункт, тем более что совсем нетрудно на какое-то время поместить образцы в морозильную камеру.
ТФЭ с обычным манифолдом мы применяем значительно реже, чем ЖЖЭ - всё-таки времени на неё уходит больше, больше манипуляций. А когда образцов много - важно ещё, чтобы они не скапливались.
Системы он-лайн подготовки для ВЭЖХ имела удовольствие видеть на одной из выставок. То, что я видела - достаточно большого размера прибор, и стоимость не низкая. Конечно, стремиться к совершенству надо, и рано или поздно мы придем к применению ТАКИХ технологий, тем более, что они более безвредные для специалиста, выполняющего пробоподготовку (в смысле - меньше дышать органикой). Но пока приходится работать тем, что есть...

[Deminolog]

Да ну не так уж и страшен черт, как его малюют Работая на ВЭЖХ люди просто чуть ли не по уши в растворителях, главное - не пить их
ТФЭ и микроТФЭ, правильно поставленные, становятся куда более экспрессным методом, нежели ЖЖЭ. Пропустить 5 мл пробы через патрон, смыть 500 мкл ацетонитрила (например), упарить, продериватизировать, разбавить и колоть - на манифолдах это очень быстро. Да даже и в ручную хорошо можно сократить время Но привыкать - да, надо. И методики ставить надо.

[Гермиона]

В статье, которой любезно поделился с нами уважаемый sch1sm нашла такой этап перед ТФЭ:

"Перед проведением ТФЭ образец мочи разбавляли 1 % раствором муравьиной
кислоты (1:1) для разрушения связей аналитов с белками."

Как вы думаете, это заменяет гидролиз (который мы обычно проводим - с концентрированной кислотой или ферментативный), или дополняет?

[Deminolog]

Не заменяет, ни в коем случае
Кислота нужна только для того, чтобы высадить белок. Вы можете взять для этого также и ТХУ или ТФУ. Но вот разрушить конъюгаты эффективно и достаточно быстро может только солянка концентрированная или фермент.

[KSS17]

Здравствуйте!

Осаждение белков 1% муркой? Разрушение связи с белками в моче?
Или бред, или в мире что-то не так...

Вымораживание может и хороший метод для выделения, но без апробации я бы им не рекомендовал развлекаться. Не исключено, что балластных веществ навымораживает столько, что эффективность данной процедуры оправдана не будет.

На опыте работы с ТФЭ могу заверить, что это лучший метод для пробоподготовки крови. Варьируя условия под аналит можно добиться очень хороших результатов, которые ни в какое сравнение с ЖЖЭ и и вымораживанием не пойдут.
Практически все количественные методики анализа наркотических и лекарственных веществ в крови мы поставили под ТФЭ, чего и остальным желаю...

[Гермиона]

Благодарю, коллеги!
Конечно, всё будем сначала пробовать, прежде чем "ставить на поток".

[Deminolog]

Осадить можно ;-) Если бы этот способ не работал - колонки не жили бы больше 100-200 вколов, думаю Хотя много лучше будет работать с ТФУ или ТХУ для этих целей Практика довольно распространенная, особенно когда речь идет о практически прямом анализе мочи, где имеет место быть только разбавление пробы, после чего центрифугирование и анализ ВЭЖХ-МС/МС.

[alexlp]

Здравствуйте!

Осаждение белков 1% муркой? Разрушение связи с белками в моче?
Или бред, или в мире что-то не так...

Вымораживание может и хороший метод для выделения, но без апробации я бы им не рекомендовал развлекаться. Не исключено, что балластных веществ навымораживает столько, что эффективность данной процедуры оправдана не будет.

На опыте работы с ТФЭ могу заверить, что это лучший метод для пробоподготовки крови. Варьируя условия под аналит можно добиться очень хороших результатов, которые ни в какое сравнение с ЖЖЭ и и вымораживанием не пойдут.
Практически все количественные методики анализа наркотических и лекарственных веществ в крови мы поставили под ТФЭ, чего и остальным желаю...

Поддерживаю 200%

[Deminolog]

Ну, значит завтра надо будет сделать подборку статей, где как раз муравьинку и используют... И не только для того, чтобы состав экстракта был максимально близок к составу подвижной фазы, а точнее, к градиенту первой ступени
Хотя еще раз повторюсь, ТФУ или ТХУ для осаждения белка подойдет лучше И, конечно, центрифугирование при 7-10 тыс об тоже необходимо
Хотя я с муравьинкой делаю пробы и уже больше 800 вколов было - полет нормальный Единственное, что могу отметить - кроме муравьинки для этой цели я добавляю ацетонитрил... Причем процентов эдак 50-60. Но это может сыграть против Вас, если будете делать потом ТФЭ (смываться будет сразу). Так что в зависимости от процедуры меняется пробоподготовка.

[D'ng]

Вымораживание может и хороший метод для выделения, но без апробации я бы им не рекомендовал развлекаться. Не исключено, что балластных веществ навымораживает столько, что эффективность данной процедуры оправдана не будет.

В начале 70-тых метод вымораживания пользовался популярностью у некоторых аналитиков , но постепенно к нему потеряли интерес. Попытки совместить вымораживание и высаливание тоже не приводили к воспроизводимым результатам.
Лично я этот метод в всерьез не рассматриваю , хотя для частных случаем он может и сгодится , но играться с концентрацией аналита в трехфазной системе (жидкость/жидкость/кристаллы) лично я не стану...