Здравствуйте, гость ( Вход | Регистрация )
Диффлизис, Chelex |
Pih |
12.11.2009 - 00:38
Сообщение
#1 |
Вновь прибывший Группа: Участники Регистрация: 11.12.2008 Пользователь №: 11 559 |
Уважаемые участники форума, спасибо Вам огромное, всегда шустро отвечаете, научите стремящегося методике диффлизиса 2 фракций с применением Chеlex-100,
пожалуйста. |
Genetik |
12.11.2009 - 20:20
Сообщение
#2 |
Участник форума Группа: СМЭ Регистрация: 23.05.2008 Пользователь №: 8 576 |
|
Зубр |
13.11.2009 - 10:52
Сообщение
#3 |
Магистр форума Группа: Модераторы Регистрация: 9.04.2007 Пользователь №: 4 766 |
Уважаемые участники форума, спасибо Вам огромное, всегда шустро отвечаете, научите стремящегося методике диффлизиса 2 фракций с применением Chеlex-100, пожалуйста. Уважаемый 'Pih'! Запрашиваемая Вами методика стала в последнее время весьма популярна. Есть куча статей, протоколов и даже книг, где этот метод исследуется и внедряется. На практике, он уже давно применяется. Прикрепляю протоколы сего касающиеся. chelex_extraction__v5.1.rar ( 16.7 килобайт ) Кол-во скачиваний: 1112 Успехов. |
Genetik |
13.11.2009 - 12:49
Сообщение
#4 |
Участник форума Группа: СМЭ Регистрация: 23.05.2008 Пользователь №: 8 576 |
Уважаемый 'Pih'! Запрашиваемая Вами методика стала в последнее время весьма популярна. Есть куча статей, протоколов и даже книг, где этот метод исследуется и внедряется. На практике, он уже давно применяется. Прикрепляю протоколы сего касающиеся. chelex_extraction__v5.1.rar ( 16.7 килобайт ) Кол-во скачиваний: 1112 Успехов. Особенно понравилась методика выделения ДНКи из косточек с помощью Килекса-100 с 30-ти минутной инкубацией при 56 градусах Цельсия. Писал явно теоретик, а не практик! Полный бред!!! |
Pih |
13.11.2009 - 23:08
Сообщение
#5 |
Вновь прибывший Группа: Участники Регистрация: 11.12.2008 Пользователь №: 11 559 |
[На практике с волосами из расчесок и следами с зубных щеток часто получалось? Спасибо опять, угощу красным сухим правильным винои при встрече.
|
Pih |
14.11.2009 - 22:24
Сообщение
#6 |
Вновь прибывший Группа: Участники Регистрация: 11.12.2008 Пользователь №: 11 559 |
Дифлизис с Килексом? Плохая идея.
Это безусловно, но шанс, полагаю, есть, иногда надо быстро, хотя быстро хорошо не бывает, но мы не верим в приметы, а когда биоматериала много - почему нет? |
Genetik |
14.11.2009 - 23:54
Сообщение
#7 |
Участник форума Группа: СМЭ Регистрация: 23.05.2008 Пользователь №: 8 576 |
|
Зубр |
15.11.2009 - 01:15
Сообщение
#8 |
Магистр форума Группа: Модераторы Регистрация: 9.04.2007 Пользователь №: 4 766 |
Дифлизис с Килексом? Плохая идея. Это безусловно, но шанс, полагаю, есть, иногда надо быстро, хотя быстро хорошо не бывает, но мы не верим в приметы, а когда биоматериала много - почему нет? Уважаемый 'Pih'! Идея может быть и плохая, но является запатентованной и давно реализована. Чтобы это не казалось пустыми словами прикрепляю статью, где проводят сравнение метода с килексом и другой новой разработки, коммерческого набора. PIIS1875176808002564_1_.rar ( 103.02 килобайт ) Кол-во скачиваний: 982 Успехов. |
Genetik |
15.11.2009 - 19:37
Сообщение
#9 |
Участник форума Группа: СМЭ Регистрация: 23.05.2008 Пользователь №: 8 576 |
Уважаемый 'Pih'! Идея может быть и плохая, но является запатентованной и давно реализована. Чтобы это не казалось пустыми словами прикрепляю статью, где проводят сравнение метода с килексом и другой новой разработки, коммерческого набора. PIIS1875176808002564_1_.rar ( 103.02 килобайт ) Кол-во скачиваний: 982 Успехов. Уважаемый Зубр! Спасибо за статью. Статья конечно интересная, но больше все-таки в для теоретических рассуждений о пользе Килекса. Дамочки в статье пишут, что они симулировали половые преступления, т.е. напихали в пробирку спермы и женских эпителиальных клеток и начали выделять Килексом. И - Das ist Fantastisch! Все получилось просто зашибись. Я Вам скажу, что со свежей спермой и эпителиальными клетками и Direct PCR без всяких проблем пойдет. А вот если бы эти уважаемые исследовательницы взяли бы ткань (например, трусы) с пятнами спермы годовалой давности (а у меня был прециндент - пятнам спермы 9 годков стунуло) и навытаскивали бы оттуда ДНКи с помощью Килекса. Вот тогда - снял бы я шляпу и поклонился бы им в ноженьки. А так: НЕ ВЕРЮ!!! Кстати, когда я читал статью, меня больше интересовал вопрос: Где они сперму то брали? С уважением. |
N G |
19.03.2010 - 13:51
Сообщение
#10 |
Новичок Группа: СМЭ Регистрация: 10.03.2010 Пользователь №: 20 495 |
т.к. являюсь участником форму сравнительно недавно, то простите, но пишу в уже устаревшие темы. Хочется сказать, что у нас была экспертиза: сперма на трусах примерно 5-летней давности. Выделены объекты Килексом и получились чудесные четкие результаты!!
это не правило, не всегда получается, но Килексное выделение мы используем ОЧЕНЬ часто!! |
rostandrei |
4.04.2010 - 18:51
Сообщение
#11 |
Участник форума Группа: Участники Регистрация: 5.12.2008 Из: г. Санкт_Петербург Пользователь №: 11 413 |
Всем здравствуйте.
Не могу понять, при чём здесь "Челексом" или "не Челексом"??? Если я правильно понимаю, дифлизис необходим для того, чтобы отделить сперму от других ненужных клеток путём разрушения этих самых ненужных клеток. Так? И если после дифлизиса в пробе мы кроме спематозоидов ничего больше не наблюдаем (а для этого необходимо сделать препаратик), то выделяйте ДНК хоть валенком :-)). Спасибо. |
genetics |
8.04.2014 - 18:11
Сообщение
#12 |
Читатель Группа: Участники Регистрация: 5.04.2014 Пользователь №: 39 269 |
Поделитесь опытом пожалуйста, сколь лучше всего внести протеиназы К, чтобы дифлизис прошел успешно с первого раза (ну или со второго уж точно)? Объект - содержимое влагалища: много влагалищного эпителия с немногочисленными сперматозоидами. Очень хочется вытянуть чистую спермальную фракцию, чтобы не "вылазила" потерпевшая... Делала: 150 мкл лизирующего раствора (который из трис-HCl, NaCl, SDS, EDTA и воды) +16 мкл протеиназы К (20 мг/мл) на 50 мкл осадка. И как-то не до конца разделяется даже после второго раунда дифлизиса. Может что-то с протеиназой? или с головой?
Заранее спасибо! |
genosys |
9.04.2014 - 12:35
Сообщение
#13 |
Опытный участник Группа: Участники Регистрация: 2.08.2011 Пользователь №: 28 146 |
Поделитесь опытом пожалуйста, сколь лучше всего внести протеиназы К, чтобы дифлизис прошел успешно с первого раза (ну или со второго уж точно)? Объект - содержимое влагалища: много влагалищного эпителия с немногочисленными сперматозоидами. Очень хочется вытянуть чистую спермальную фракцию, чтобы не "вылазила" потерпевшая... Делала: 150 мкл лизирующего раствора (который из трис-HCl, NaCl, SDS, EDTA и воды) +16 мкл протеиназы К (20 мг/мл) на 50 мкл осадка. И как-то не до конца разделяется даже после второго раунда дифлизиса. Может что-то с протеиназой? или с головой? Заранее спасибо! Во-первых, абсолютно чистую спермальную фракцию получить не всегда возможно, да и не нужно (достаточно довести до >10% муж. ДНК в образце). Дело в том, что мужская ДНК при дифф. лизисе теряется и чем выше очистка, тем больше потери. Во-вторых, у Вас что-то слишком много протеиназы, достаточно раза в 3 меньше (слишком много постороннего белка очистке тоже не способствует). В-третьих, на такой объем осадка буфера надо бы раза в 2-3 больше брать (перегруз материалом -> хуже очистка). Ну и наконец, если есть возможность, пользуйтесь промеговским Differex'ом. Он дает наилучший результат: |
genetics |
9.04.2014 - 19:26
Сообщение
#14 |
Читатель Группа: Участники Регистрация: 5.04.2014 Пользователь №: 39 269 |
Во-первых, абсолютно чистую спермальную фракцию получить не всегда возможно, да и не нужно (достаточно довести до >10% муж. ДНК в образце). Дело в том, что мужская ДНК при дифф. лизисе теряется и чем выше очистка, тем больше потери. Во-вторых, у Вас что-то слишком много протеиназы, достаточно раза в 3 меньше (слишком много постороннего белка очистке тоже не способствует). В-третьих, на такой объем осадка буфера надо бы раза в 2-3 больше брать (перегруз материалом -> хуже очистка). Ну и наконец, если есть возможность, пользуйтесь промеговским Differex'ом. Он дает наилучший результат: Спасибо огромное! Дифферекс есть, но пока не пробовали... Надо будет с ним поэкспериментировать... Просто билась-билась с дифлизисом именно с этим объектом... все равно смесь не стала уже дальше доочищать дабы вообще сперматозоиды не потерять... придется смесь давать. Плюс Y-filer'ом поставила - чистенько получился. Вместе, думаю, достаточно будет... |
genosys |
9.04.2014 - 20:13
Сообщение
#15 |
Опытный участник Группа: Участники Регистрация: 2.08.2011 Пользователь №: 28 146 |
Просто билась-билась с дифлизисом именно с этим объектом... все равно смесь не стала уже дальше доочищать дабы вообще сперматозоиды не потерять... придется смесь давать. Плюс Y-filer'ом поставила - чистенько получился. Вместе, думаю, достаточно будет... Это нормально, см. статью по ссылке (доступ открытый). Там тоже в одном из образцов чистую мужскую ДНК выделить не удавалось в разных лабах и разными методами. Дело индивидуальное, зависит от образца, можете себя не винить |
Сейчас: 19.04.2024 - 18:26 |