[Odessit]

Уважаемые коллеги, здравствуйте!
Помогите пожалуйста в вопросе об установлении возраста человека по образцам слюны с применением ДНК-анализа, в принципе о возможности проведения такого анализа для криминалистических целей в судебно-медицинской молекулярно-генетической лаборатории. Интересует практически все!!!
Заранее благодарен за помощь!!

[Gordiz]

Уважаемые коллеги, здравствуйте!
Помогите пожалуйста в вопросе об установлении возраста человека по образцам слюны с применением ДНК-анализа, в принципе о возможности проведения такого анализа для криминалистических целей в судебно-медицинской молекулярно-генетической лаборатории. Интересует практически все!!!
Заранее благодарен за помощь!!

Уважаемый Odessit!
В настоящее время нет надежных методов определения возраста человека по ДНК. Есть методы, дающие очень большой разброс: подсчет хромосомных аббераций в лимфоцитах, оценка гетероплазмии мтДНК или длины теломерных участков хромосом. Наиболее точный метод основан на количественном анализе перестроек гена TCR в Т-лимфоцитах и отражает активность тимуса, которая в свою очередь связана с возрастом. Метод описан в прикрепленной статье, дает разброс +/- 9 лет при условии, что человек здоров. Но все эти методы неприменимы к образцам слюны.

[Odessit]

Уважаемый Odessit!
В настоящее время нет надежных методов определения возраста человека по ДНК. Есть методы, дающие очень большой разброс: подсчет хромосомных аббераций в лимфоцитах, оценка гетероплазмии мтДНК или длины теломерных участков хромосом. Наиболее точный метод основан на количественном анализе перестроек гена TCR в Т-лимфоцитах и отражает активность тимуса, которая в свою очередь связана с возрастом. Метод описан в прикрепленной статье, дает разброс +/- 9 лет при условии, что человек здоров. Но все эти методы неприменимы к образцам слюны.

Здравствуйте уважаемый Gordiz! Спасибо за ответ! Однако, у нас некоторые спецы считают, что внедрение свежих открытий в практику является приоритетной задачей для судебных генетиков. А именно, интернет завален - "открытиями, определения возраста по слюне (буккальный эпителий), основанными на изучении процессов метилирования ДНК и обнаружения надежных маркеров старения, Калифорния". Можно узнать Ваше мнение на этот счет. Спасибо!

[Gordiz]

А именно, интернет завален - "открытиями, определения возраста по слюне (буккальный эпителий), основанными на изучении процессов метилирования ДНК и обнаружения надежных маркеров старения, Калифорния". Можно узнать Ваше мнение на этот счет. Спасибо!

Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.

[Odessit]

Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.

Вечер добрый, уважаемый Gordiz и коллеги! Спасибо за Ваше мнение!
Если я правильно Вас понял, если нет, исправьте пожалуйста! Вы считаете, что есть возможность проведения фрагментного анализа (микросателлитные локусы) с целью определения поставленной задачи?! Это в принципе очень важно и актуально при расследовании половых преступлений! Как вы думаете, можно применить данный фрагментный анализ при работе со биоследами (любыми)?
Спасибо за помощь!!!!

[Gordiz]

Вечер добрый, уважаемый Gordiz и коллеги! Спасибо за Ваше мнение!
Если я правильно Вас понял, если нет, исправьте пожалуйста! Вы считаете, что есть возможность проведения фрагментного анализа (микросателлитные локусы) с целью определения поставленной задачи?! Это в принципе очень важно и актуально при расследовании половых преступлений! Как вы думаете, можно применить данный фрагментный анализ при работе со биоследами (любыми)?
Спасибо за помощь!!!!

Уважаемый Odessit!
Если создавать систему для практического использования опубликованных данных, необходимо наладить одновременный анализ шести мишеней: метилированное и неметилированное состояние для каждого из трех наиболее информативных маркеров, описанных в статье. Желательно, чтобы соблюдался принцип: один образец - одна пробирка (т.е. мультиплекс) и использовался метод колличественной детекции, уже имеющийся в действующих судебно-генетических лабораториях. Таких методов два: Real-Time PCR и фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Предпочтительным методом является Real-Time PCR, поскольку он дает более точную колличественную оценку. Но, к сожалению, у нас судебно-генетические лаборатории комплектуются морально устаревшими приборами ABI 7000/7500, малопригодными для проведения мультиплексыных реакций.
Остается фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Описаны разные возможности использования этого метода для количественной оценки степени метилирования: аллель-специфичная ПЦР после бисульфитной конверсии, однонуклеотидная достройка праймеров, метилчувствительные рестриктазы. Но в любом случае это будет совершенно новая система, никак не связанная с анализом тандемных повторов.
И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.

[Зубр]

Доброго времени суток, коллеги!

И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.

И вместе с тем, чтобы этот метод возымел практическое значение не достаточно валидации в какой-то одной лаборатории. Это должна быть масштабная работа нескольких центров судгенетики с серией публикаций в ведущих журналах, причём эта работа заранее не обречена на успех, так как не всё может оказаться адекватно задуманному, могут возникнуть сложности и прочие моменты неопределённости. Посему, уповать на быстрое и надёжное внедрение в практику только что совершённого изобретения - я бы не стал.
Всем привет.

[genosys]

Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.

Господа, товарищи и бояре, читайте статьи в Плос1 исключительно критически! Заявленная точность метода в 5.2 года - это на самом деле среднее по разнице между реальным и наблюдаемым возрастом (residuals), что является, мягко говоря, нестандартной оценкой точности. Если тот же самый "метод" использовать для оценки точности sjTREC метода, то он окажется раза в 2 лучше, чем установление возраст по метилированию ДНК в слюне. Соот-но, если рассчитать нормально, как общепринято, Стандартную Ошибку Оценки (SEE) для слюны, то она составит порядка +/- 15 лет.
Тем не менее, метилирование ДНК - действительно мощный предиктор хронологического возраста. Жаль только, что некоторые пидорасы недобросовестные ученые умудряются тискать паршивые статейки в паршивых журанальчиках поперед ответственных ученых

Доброго времени суток, коллеги!

И вместе с тем, чтобы этот метод возымел практическое значение не достаточно валидации в какой-то одной лаборатории. Это должна быть масштабная работа нескольких центров судгенетики с серией публикаций в ведущих журналах, причём эта работа заранее не обречена на успех, так как не всё может оказаться адекватно задуманному, могут возникнуть сложности и прочие моменты неопределённости. Посему, уповать на быстрое и надёжное внедрение в практику только что совершённого изобретения - я бы не стал.
Всем привет.

Совершенно верно! Эта "масштабная работа без шансов на успех" называется Developmental Validation - практически стандарт для новых ДНК-методов.

Уважаемый Odessit!
Если создавать систему для практического использования опубликованных данных, необходимо наладить одновременный анализ шести мишеней: метилированное и неметилированное состояние для каждого из трех наиболее информативных маркеров, описанных в статье. Желательно, чтобы соблюдался принцип: один образец - одна пробирка (т.е. мультиплекс) и использовался метод колличественной детекции, уже имеющийся в действующих судебно-генетических лабораториях. Таких методов два: Real-Time PCR и фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Предпочтительным методом является Real-Time PCR, поскольку он дает более точную колличественную оценку. Но, к сожалению, у нас судебно-генетические лаборатории комплектуются морально устаревшими приборами ABI 7000/7500, малопригодными для проведения мультиплексыных реакций.
Остается фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Описаны разные возможности использования этого метода для количественной оценки степени метилирования: аллель-специфичная ПЦР после бисульфитной конверсии, однонуклеотидная достройка праймеров, метилчувствительные рестриктазы. Но в любом случае это будет совершенно новая система, никак не связанная с анализом тандемных повторов.
И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.

Реально, методов конечно больше, чем два, причем "морально устаревшие" ABI вполне для этих методов пригодны (собс-но они неплохо годятся и для мултиплексной ПЦР, кабы этот мультиплекс вообще был нужен...). Например, с использованием рестирктаз, чувствительных к метилированию. А вот бисульфитная конверсия для криминалистических образцов как раз мало подходит, уж больно кол-ва исходной ДНК требуются (не верьте рекламам про суб-нанограмную чувствительноть бисульфитных китов, реально нужны сотни нг для надежной работы!).

[Gordiz]

Заявленная точность метода в 5.2 года - это на самом деле среднее по разнице между реальным и наблюдаемым возрастом (residuals), что является, мягко говоря, нестандартной оценкой точности.

Авторы выбрали метод оценки адекватный размеру выборки. Понятно, что на 60 образцах красивую статистику не сделаешь. Тем не менее, работа заслуживает уважения независимо от погрешности предложенного метода.

Совершенно верно! Эта "масштабная работа без шансов на успех" называется Developmental Validation

Полагаю, что никто пока не может знать, каковы шансы на успех.

Реально, методов конечно больше, чем два,

Если мы говорим о внедрении в судебную генетику, то методов детекции пока все-таки два. Обсуждать пиросеквенаторы, масспектрометры, а так же подходы на основе клонирования смысла нет.

причем "морально устаревшие" ABI вполне для этих методов пригодны (собс-но они неплохо годятся и для мултиплексной ПЦР, кабы этот мультиплекс вообще был нужен...).

Искренне рад за Вашу фирму, но обычно, когда говорят о МУЛЬТИплексе, подразумевают более трех мишеней .
Помимо методических сложностей есть более существенный вопрос: будет ли вообще востребован этот метод при условии успешного создания тест-системы? В большинстве цивилизованных стран судебным генетикам запрещено законом использовать маркеры, связанных с фенотипом. Исключение составляет лишь локус амелогенина, который отстояли после острых дискуссий. Поэтому перспективы весьма ограничены.

[genosys]

Авторы выбрали метод оценки адекватный размеру выборки. Понятно, что на 60 образцах красивую статистику не сделаешь. Тем не менее, работа заслуживает уважения независимо от погрешности предложенного метода.

Да какое пардон уважение?! Статистику нужно делать правильную, а не красивую, независимо от размера выборки Эти шустрые ребята прогнали откровенную лажу, при попустительстве редакции Плос1, теперь все нормальные ученые должны "оправдываться" почему их метод якобы дает бОльшую ошибку. За такое канделябрами бьют, а не уважают!

Полагаю, что никто пока не может знать, каковы шансы на успех.

ну, я не зря лопату поставил Есс-но, Developmental validation для того и делается, чтобы эти шансы оценить.

Если мы говорим о внедрении в судебную генетику, то методов детекции пока все-таки два. Обсуждать пиросеквенаторы, масспектрометры, а так же подходы на основе клонирования смысла нет.

Массовое использование даже qPCR - это достаточно печальная тема ввиду квалификации большинства "экспертов", но единичные экспертизы в хороших лабах вполне возможно сделать любыми методами.

Искренне рад за Вашу фирму, но обычно, когда говорят о МУЛЬТИплексе, подразумевают более трех мишеней .

Строго говоря, мульти- = это больше, чем одна детекция в пробирке. Другое дело, что разработать хороший даже даблплекс уже реально непростая задача, если делать все грамотно для точной количественной оценки. Триплекс и выше - уже можно практически забыть, что удасться оптимизировать олиги так что они не будут взаимно влиять на эффективность ПЦР каждой отдельной реакции. У ABI 7300 если не ошибаюсь, 4 канала, один на ROX, вот как раз оставшихся для триплекса достаточно. Но я что-то не знаю ни одного форензик qPCR теста с триплексом...

Помимо методических сложностей есть более существенный вопрос: будет ли вообще востребован этот метод при условии успешного создания тест-системы? В большинстве цивилизованных стран судебным генетикам запрещено законом использовать маркеры, связанных с фенотипом. Исключение составляет лишь локус амелогенина, который отстояли после острых дискуссий. Поэтому перспективы весьма ограничены.

В Голландии например с законодательством в этом смысле все в порядке. В Германии недавно разрешили пренатальную (даже предимплантационную) ген. диагностику эмбрионов, дойдет и до предсказания фенотипов по ДНК. Тут я, скорее, оптимист

Сообщение отредактировал Зубр - 3.08.2011 - 09:53

[Gordiz]

Другое дело, что разработать хороший даже даблплекс уже реально непростая задача, если делать все грамотно для точной количественной оценки. Триплекс и выше - уже можно практически забыть, что удасться оптимизировать олиги так что они не будут взаимно влиять на эффективность ПЦР каждой отдельной реакции.

Когда-то создание STR-триплекса считалось непростой задачей. Сейчас все пользуются STR-мультиплексами с десятками олигов в одной пробирке, и олиги особо не мешают друг другу работать колличественно. Подтверждением тому является применение мультиплексных систем для колличественного анализа химеризма после пересадки костного мозга. Почему же олиги вдруг начнут мешать друг другу попав в прибор для RealTime? Что реально мешает, так это слабая аппаратная и программная реализация мультиканальной детекции. По этой причине для "многоканального" ABI 7000 одновременный анализ более двух мишеней противопоказан , а это самый массовый прибор в экспертных лабораториях России.

Но я что-то не знаю ни одного форензик qPCR теста с триплексом...

Чем Quantifiler DUO не триплекс? Внутренний контроль - тоже колличественная мишень.

В Голландии например с законодательством в этом смысле все в порядке.

Голландия вообще во многих смыслах раскрепощенная страна . Но в целом наблюдается тенденденция к усилению защиты прав граждан. А раскрытие информации о фенотипе в ходе генетической экспертизы считается грубым нарушением этих прав, поэтому разработки в области предсказания внешних признаков скорее всего массового применения не найдут. К сожалению.

[genosys]

Когда-то создание STR-триплекса считалось непростой задачей. Сейчас все пользуются STR-мультиплексами с десятками олигов в одной пробирке, и олиги особо не мешают друг другу работать колличественно. Подтверждением тому является применение мультиплексных систем для колличественного анализа химеризма после пересадки костного мозга. Почему же олиги вдруг начнут мешать друг другу попав в прибор для RealTime? Что реально мешает, так это слабая аппаратная и программная реализация мультиканальной детекции. По этой причине для "многоканального" ABI 7000 одновременный анализ более двух мишеней противопоказан , а это самый массовый прибор в экспертных лабораториях России.

Меня всегда напрягает, когда по фореграммам мултиплекса с десятками мишеней начинают какие-то количественные выводы делать. Видимо все-таки школы разные и представления о точности соот-но, мне после мРНК маркеров это ересью кажется
Олиги имеют св-во отжигаться друг на друге, образовывать димеры и пр., любой мультиплекс стараются оптимизировать на этапе дизайна праймеров с помощью соответственных программ (которые впрочем помогают далеко не всегда). Чем больше олигов в кучу намешать, тем меньше шансов на успех. Т.е добиться амплификации десятка мишеней не так и сложно, сложно устранить предпочтительную амплификацию одних мишеней в ущерб остальным, тут еще и размер ампликона влияет. Перекрытие каналов тоже имеет место, но тот же Quantifiler DUO на 7300 работает, т.е. NED, VIC и FAM (+ROX) друг другу не особо мешают, насчет 7000 не в курсе.

Чем Quantifiler DUO не триплекс? Внутренний контроль - тоже колличественная мишень.

да, Вы правы, про IPC я и забыл Ну, все-таки согласитесь, мултиплексная qPCR вещь достаточно непростая для разработки.

Голландия вообще во многих смыслах раскрепощенная страна . Но в целом наблюдается тенденденция к усилению защиты прав граждан. А раскрытие информации о фенотипе в ходе генетической экспертизы считается грубым нарушением этих прав, поэтому разработки в области предсказания внешних признаков скорее всего массового применения не найдут. К сожалению.

О, на эту тему можно так развернуться! Например, нарушает ли ДНК-реконструкция внешности гражданские права трупа? И не является ли усилением прав живых граждан предоставление полиции доп. инструмента в расследованиях? Реально же я считают, что будет как у Хайнлайна: будет скафандр - будет и путешествие

[Gordiz]

Меня всегда напрягает, когда по фореграммам мултиплекса с десятками мишеней начинают какие-то количественные выводы делать.

Напрасно напрягаетесь. На искусственных смесях ошибка составляет несколько процентов.

Т.е добиться амплификации десятка мишеней не так и сложно, сложно устранить предпочтительную амплификацию одних мишеней в ущерб остальным,

Но опыт создания больших мультиплексов для капиллярников как раз демонстрирует возможность равномерной амплификации множества мишеней в достаточно широком диапазоне концентраций. При этом может снижаться эффективность ПЦР, но как известно, это не является препятствием для колличественной оценки.

тут еще и размер ампликона влияет.

Безусловно. Но в отличие от капиллярников для РеалТайма можно сделать все мишени примерно одинаковой длины.

Перекрытие каналов тоже имеет место

Да, вот это и есть узкое место мультиплексного реалтайма, а не взаимодействие праймеров.

но тот же Quantifiler DUO на 7300 работает, т.е. NED, VIC и FAM (+ROX) друг другу не особо мешают

Но этот прибор вышел лет 7 назад, а то и больше. Современные приборы (в том числе и от ABI) предоставляют одновременную детекцию от 6 красителей (без всяких нелепых референсных ROX) + FRET как потенциальный увеличитель мультиплексности. Так что думаю до 10 мишеней вполне реально расширить возможности одно реакции.

да, Вы правы, про IPC я и забыл Ну, все-таки согласитесь, мултиплексная qPCR вещь достаточно непростая для разработки.

Да, но кому интересно заниматься простыми вещами?

О, на эту тему можно так развернуться! Например, нарушает ли ДНК-реконструкция внешности гражданские права трупа? И не является ли усилением прав живых граждан предоставление полиции доп. инструмента в расследованиях?

А что если Вы обнаружите у трупа алопецию, которую он тщательно скрывал при жизни? Или вдруг, знаменитая блондинка окажется всего лишь крашеной? Все ли готовы к перспективе такого конфуза?

Реально же я считают, что будет как у Хайнлайна: будет скафандр - будет и путешествие

Вот пусть Ваша компания (которую я безгранично уважаю ) предоставит прибор, пригодный для реальных мультиплексов, тогда и полетим. Возможно ViiA 7 и есть такой прибор, но пока не слышно отзывов.

[genosys]

Напрасно напрягаетесь. На искусственных смесях ошибка составляет несколько процентов.
Но опыт создания больших мультиплексов для капиллярников как раз демонстрирует возможность равномерной амплификации множества мишеней в достаточно широком диапазоне концентраций. При этом может снижаться эффективность ПЦР, но как известно, это не является препятствием для колличественной оценки.

вот-вот, именно такая уверенность, неизвестно на чем основанная, меня и напрягает
Какие "несколько процентов"?! Разница в эффективности ПЦР в 5% через 30 циклов вызывает более чем двухкратную разницу в амплификации мишени (2^30 vs 1.95^30). Но 5% - это цветочки! Некие "гении" попытались мои два синглплекса тупо в дуплекс превратить, так у них эффективность мультиплекса составила 60% (это с почти 100% исходных), самое интересно, что они мне еще и претензии высказали, тоже были уверены в "равномерной амплификации множества мишеней"

[Gordiz]

вот-вот, именно такая уверенность, неизвестно на чем основанная, меня и напрягает
Какие "несколько процентов"?! Разница в эффективности ПЦР в 5% через 30 циклов вызывает более чем двухкратную разницу в амплификации мишени (2^30 vs 1.95^30).

Уверенность основана на опыте прогрессивной части человечества В случае колличественной ПЦР как правило параллельно с образцами ставятся колличественные стандарты. При этом точность колличественной оценки не зависит от эффективности ПЦР при условии, что в стандартах и образцах эффективность ПЦР одинаковая. Эффективность важна скорее для чувствительности системы. При эффективности 60% может просто не хватить циклов, чтобы что-то увидеть.