[rostandrei]

Здравствуйте уважавемые коллеги!
Впервые столкнулся с таким явлением.
В результате проведённого электрофореза при исследовании ДНК выделенной из костной ткани на элетрофорграмме получился "частокол" пиков очень похожий на леддер. Причём подавляющее количество пиков попало в бины. Высота пиков в пределахлокусов миеняется волнообразно.
При исследовании использовал мультилокусный набор Айдентифайлер и Минифайлер.
Мне сказали это так называемый леддер эффект который проявляется при ПЦР деградированной ДНК.
Кто-нибудь сталкивался с таким явлением? И вообще возможно ли в этом случае получить нормальный профиль?
У меня такая ситуация, что из четырёх костей (останки разных людей) в трёх получилось то о чём я написал.

Выделял ДЖНК ПрепФайлером с БТА буфером.

[Зубр]

Уважаемый 'rostandrei'!

Здравствуйте уважавемые коллеги!
Впервые столкнулся с таким явлением.
В результате проведённого электрофореза при исследовании ДНК выделенной из костной ткани на элетрофорграмме получился "частокол" пиков очень похожий на леддер. Причём подавляющее количество пиков попало в бины. Высота пиков в пределахлокусов миеняется волнообразно.
При исследовании использовал мультилокусный набор Айдентифайлер и Минифайлер.
Мне сказали это так называемый леддер эффект который проявляется при ПЦР деградированной ДНК.
Кто-нибудь сталкивался с таким явлением? И вообще возможно ли в этом случае получить нормальный профиль?
У меня такая ситуация, что из четырёх костей (останки разных людей) в трёх получилось то о чём я написал.

Выделял ДЖНК ПрепФайлером с БТА буфером.

Разрешите несколько уточняющих вопросов.
1. Какова концентрация ДНК по Quantifiler?
2. Все системы дают "леддер-эффект" или часть?
3. Какое состояние костей?
Но даже без ответа на эти вопросы, можно сказать, что, скорее всего, придётся перевыделять ДНК из трёх костей. Что-то с выделением, проанализируйте все этапы.
Успехов.

[rostandrei]

Уважаемый 'rostandrei'!

Разрешите несколько уточняющих вопросов.
1. Какова концентрация ДНК по Quantifiler?
2. Все системы дают "леддер-эффект" или часть?
3. Какое состояние костей?
Но даже без ответа на эти вопросы, можно сказать, что, скорее всего, придётся перевыделять ДНК из трёх костей. Что-то с выделением, проанализируйте все этапы.
Успехов.

1. Концентрация ДНК 0,010; 0,012 0,018 нг/мкл
2. Все системы, в разной степени, дают указанный эффект.
3. Чисто внешне кости не кажутся "убитыми". Достаточно плотные, внутри костный мозг (в виде вонючего жировоска).

Может это от набора для выделения зависит? При использовании фенольного метода, такого не было.

Спасибо

[rostandrei]

1. Концентрация ДНК 0,010; 0,012 0,018 нг/мкл
2. Все системы, в разной степени, дают указанный эффект.
3. Чисто внешне кости не кажутся "убитыми". Достаточно плотные, внутри костный мозг (в виде вонючего жировоска).

Может это от набора для выделения зависит? При использовании фенольного метода, такого не было.

Спасибо

Попытаюсь картинки прикрепить.

Сообщение отредактировал rostandrei - 19.12.2011 - 09:04

[rostandrei]

Попытаюсь картинки прикрепить.

Сообщение отредактировал rostandrei - 19.12.2011 - 09:38

[rostandrei]

[/quote]

Сообщение отредактировал rostandrei - 19.12.2011 - 09:42

[aziz-med]

Здравствуйте уважавемый коллега
извините, но я еще не сталкивался типо таких случаях, так что извините коллега

[Зубр]

Уважаемый коллега 'rostandrei'!

1. Концентрация ДНК 0,010; 0,012 0,018 нг/мкл...

Низковата концентрация, конечно (полагаю, что объём пробы = 50мкл). Если Вы в полный объём ПЦР вносите 10 мкл, то всего 100pg на реакцию. Это бы ещё ничего, но, скорее всего, ДНК в пробах изрядно деградирована. Это подтверждает и Ваш второй пункт.

...2. Все системы, в разной степени, дают указанный эффект...

...3. Чисто внешне кости не кажутся "убитыми". Достаточно плотные, внутри костный мозг (в виде вонючего жировоска).
Может это от набора для выделения зависит? При использовании фенольного метода, такого не было.
Спасибо

Полагаю, что дело в выделении. Где-то в протоколе надо искать слабое звено. Попробуйте на одной из костей выделить фенолом, станет многое ясно.
Успехов.

[Gordiz]

Уважаемый rostandrei!
Очевидно проблема в контаминации аллельным лэддером. Это особенно хорошо видно на первом рисунке. На хороших образцах контаминация может быть незаметной, поскольку вносимое количество ДНК успешно конкурирует с загрязнением (пока!). А в случае с костями, образца явно не хватает и преимущественно амплифицируется привнесенный лэддер. Скорее всего, количество вносимой ДНК образца еще меньше, чем Вы предполагаете. Для деградированной ДНК из костей результаты Quantifiler неинформативны, поскольку величина мишени у этого набора - 65 bp, что совершенно не актуально при анализе STR.
Среди людей, которые не верят в контаминацию, бытует суеверие, что данный “эффект лэддера” – это свойство деградированных образцов ДНК. Это удобная точка зрения, но она не объясняет, почему картинка по составу аллелей совпадает с коммерческим лэддером из набора.
Если повторять экстракцию ДНК, лучше сменить все реактивы, поскольку контаминация может быть на любом этапе: может быть загрязнен сам вещдок, набор для выделения , набор для амплификации, или все сразу.
Но проще поставить амплификацию с альтернативным набором. Другие праймеры в большинстве локусов не будут амплифицировать лэддер. Еще надежнее взять набор с локусами, отсутствующими в Identifiler и Minifiler.

[Зубр]

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

Уважаемый rostandrei!
Очевидно проблема в контаминации аллельным лэддером. Это особенно хорошо видно на первом рисунке. На хороших образцах контаминация может быть незаметной, поскольку вносимое количество ДНК успешно конкурирует с загрязнением (пока!). А в случае с костями, образца явно не хватает и преимущественно амплифицируется привнесенный лэддер. Скорее всего, количество вносимой ДНК образца еще меньше, чем Вы предполагаете. Для деградированной ДНК из костей результаты Quantifiler неинформативны, поскольку величина мишени у этого набора - 65 bp, что совершенно не актуально при анализе STR...

Ваши рассуждения логичны. Логичны во всём, кроме одного: все слабые пробы должны быть контаминированы леддером. Коллега rostandrei обратил бы на это внимание, но проблема возникла именно с этими 3-мя костями. Предположим, что это "серия", то-есть загрязнение попало именно в этот раунд. Тогда и отрицательный контроль должен выглядеть аналогичным образом. Кстати, на фореграммах по ряду систем не все аллели леддера представлены, много пустот, один пик больше - другой меньше и нет плавности (синусоиды).

...Но проще поставить амплификацию с альтернативным набором. Другие праймеры в большинстве локусов не будут амплифицировать лэддер. Еще надежнее взять набор с локусами, отсутствующими в Identifiler и Minifiler.

Да, конечно, для проверки гипотезы, а может и для получения таки результата генотипирования, этот вариант подходит. С другой стороны, в Identifiler и Minifiler разные праймеры, а контаминация есть в том и другом случае.
Всем привет.

[Gordiz]

Логичны во всём, кроме одного: все слабые пробы должны быть контаминированы леддером. Коллега rostandrei обратил бы на это внимание, но проблема возникла именно с этими 3-мя костями. Предположим, что это "серия", то-есть загрязнение попало именно в этот раунд. Тогда и отрицательный контроль должен выглядеть аналогичным образом. Кстати, на фореграммах по ряду систем не все аллели леддера представлены, много пустот, один пик больше - другой меньше и нет плавности (синусоиды).

Уважаемый Зубр,
Коллега rostandrei не утверждал и обратного, поэтому мы не знаем как выглядят другие слабые образцы и отрицательный контроль. Но предполагаю, что если провести отрицательный контроль начиная с этапа выделения ДНК, в нем аллельная лестница проявит себя со всей подобающей плавностью и без пробелов, поскольку будет отсутствовать конкурирующая матрица.

С другой стороны, в Identifiler и Minifiler разные праймеры, а контаминация есть в том и другом случае.
Всем привет.

Скорее всего праймеры Minifiler способны амплифицировать лэддер Identifiler.

[rostandrei]

Уважаемые коллеги!
Огромное спасибо за представленные ответы и дискусию.
Для объективности внесу некоторые подробности. В серии РеалТайм-ПЦР-Форез присутствовало объектов на 5 ранов (17 шт.) это три кости, 13 образцов и 1 - спермальная фракция после дифф. лизиса с тампона с содержимым прямой кишки. Из исследованных проб кроме костей "слабым" по концентрации была проба спермальной фракции - 0,006 нг/мкл (при IPC 27). Понятно что представленную цифру принято принимать как отсутствие ДНК. Кроме того объект был представлен после биологии где спематозиодов не нашли,а дали наличие спермальной жидкости (т.к. PSA был+). Однако, попытавшись выжать из неё хоть что-то, я её сконцентрировал и поставил на ПЦР. В результате, конечно, ноль, но и лишнего ничего не вылезло.
Отрицательный контроль так же никакой контаминации не показал.
Думаю что на этапах РеалТайм-ПЦР-Форез контаминации не было.

Кроме того, одну из трёх костей перевыделял тем же Препфайлером параллельно с четвёртой костью (из Норильска). В результате перевыделенная дает леддер эффект, норильская проходит идеально - ну прямо как образец.

Думаю что всётаки дело в деградации. Представленные три кости с 2002 года лежали в земле под дачным домиком.

[Gordiz]

В результате, конечно, ноль, но и лишнего ничего не вылезло. Отрицательный контроль так же никакой контаминации не показал. Думаю что на этапах РеалТайм-ПЦР-Форез контаминации не было. Кроме того, одну из трёх костей перевыделял тем же Препфайлером параллельно с четвёртой костью (из Норильска). В результате перевыделенная дает леддер эффект, норильская проходит идеально - ну прямо как образец. Думаю что всётаки дело в деградации. Представленные три кости с 2002 года лежали в земле под дачным домиком.

Уважаемый rostandrei!
Хорошо, что реактивы у Вас чистые. Но все же контаминация мне кажется единственным рациональным объяснением. Может быть человек, который пилил кости перед этим раскапывал форезную плашку или еще что-нибудь в этом роде. Как я понимаю, в Норильской кости концентрация ДНК выше?

[Зубр]

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

Уважаемый rostandrei!
Хорошо, что реактивы у Вас чистые. Но все же контаминация мне кажется единственным рациональным объяснением. Может быть человек, который пилил кости перед этим раскапывал форезную плашку или еще что-нибудь в этом роде. Как я понимаю, в Норильской кости концентрация ДНК выше?

И в той , и в другой предложенной версии есть несостыковки. Возможно, ответ где-то посередине. Т.е., есть и деградация, но есть и контаминация. Причём, мне кажется, что это контаминация не аллельным леддером, а суммой разных генотипов сотрудников лаборатории (а может и не только сотрудников). На сверхмалых количествах полагаю это возможно. Как Вам такая версия?
По поводу аллельного леддера и контаминации, прикрепляю полезную статью.
 DNA_Contamination.pdf ( 330.95 килобайт ) Кол-во скачиваний:  3114

Всем привет.

[rostandrei]

Уважаемый rostandrei!
Хорошо, что реактивы у Вас чистые. Но все же контаминация мне кажется единственным рациональным объяснением. Может быть человек, который пилил кости перед этим раскапывал форезную плашку или еще что-нибудь в этом роде. Как я понимаю, в Норильской кости концентрация ДНК выше?

Да, в Норильской кости концентрация ДНК 0,803 нг/мкл.

Мне подсказали, что этот эффект изучался Ивановым П.Л. В журнале "Судебно-медицинская экспертиза" за 2000 год сент-окт.; 43(5): 32-7 есть статья на эту тему.
Но я что-то не смог её найти...

С уважением, rostandrei.