[hot_assay]

Глубокоуважаемые коллеги!

Задача: количественное определение клозапина в сыворотке методом ГХ/МС.
Пробоподготовка - жидкость-жидкостная экстракция (экстрагент - хлористый метилен).
Вопрос: каков оптимальный (в плане быстроты и эффективности) подход к разрушению связей клозапина с белками? (по данным литературы, свободная фракция около 5%, остальное связано с белками).

Заранее благодарю!

Сообщение отредактировал hot_assay - 19.02.2012 - 16:57

[chemist-sib]

Доброго времени суток!
Наш скромный опыт свидетельствует, что солянокислый гидролиз (типа бензодиазепинового или опиатного) для азалептина - "самое то". Но - даже на кипящей водяной бане, в течение 1-1,5 часов - длителен. В 2007 году Соколова О.И. защитила диссертацию по азалептину; к сожалению, не смог найти ее автореферата в бесплатном виде в Сети, вот - некоторые "выжимки" из него
http://www.dissercat.com/content/opredelen...om-issledovanii
Цитирую по своему бумажному экземпляру: "Для извлечения азалептина из крови применяли вариант жидклсть-жидкостной экстракции с дополнительными процессами: разбавление крови водой, ультразвуковое воздействие, осаждение в извлечении белков 10% раствором натрия вольфрамата при рН 2 (депротеинизирующий агент), нагревание до температуры 40-50 оС, центрифугирование. Процент извлечения азалептина... составил... из крови - 60%."
Есть еще мысль попробовать на азатептине в качестве депротеинизатора ацетон (он показался нам для крови на примере некоторых лекарственных веществ - пиразинамида, теофиллина... - очень удобным); просто добавить ацетон к объекту, выболтать, отцентрифугировать и, при необходимости, разбавив водой и - возможно - добавив щелочь (мы во многих случаях извлекали при физиологическом значении рН среды), экстрагировать.
Успехов!

Сообщение отредактировал chemist-sib - 19.02.2012 - 18:46

[hot_assay]

Доброго времени суток!
Наш скромный опыт свидетельствует, что солянокислый гидролиз (типа бензодиазепинового или опиатного) для азалептина - "самое то". Но - даже на кипящей водяной бане, в течение 1-1,5 часов - длителен.

Большое спасибо, попробуем!

[KSS17]

Здравствуйте!
Посмотрите и это:
А.Б.Мелентьев, И.В. Курочкина. Определение клозапина в крови и моче методом ГХ - МС.//СМЭ,-1999,-№4,-С.27-29.

[hot_assay]

вопрос возник в связи с тем, что в образцах сывороток, где требовалось определить концентрацию клозапина, значения оказались неправдоподобно низкими (калибровка осуществлялась по модельным смесям с внутренним стандартом диазепамом).

Возможно ли, что при прямой экстракции хлористым метиленом определяется только свободная фракция клозапина?
(если честно, я никогда не думал, что связи с сывороточными белками настолько прочны, что для разрушения требуют условий, подобных кислотному гидролизу при выявлении опиатов; у А.Б. Мелентьева, например, в методике количественного определения амитриптилина в крови (свободная фракция - 4%) используется прямая жидкость-жидкостная экстракция и нет ни слова о разрушении связей с белками).

В общем, добавили соляной кислоты, нагрели - никакой разницы с прямой экстракцией.

[KSS17]

Здравствуйте!
Высокая липофильность способствует образованию довольно прочных "связей" с белками... Когда делали трициклические по Мелентьеву, то эффективность ЖЖЭ составляла от 5 до 15 %. Даже ТФЭ экстракция из крови для амитриптилина порядка 60% выходит.

Калибруйтесь по аналогичной матрице (кровь, плазма, сыворотка) и процент экстракции будет относительно учтен...

[hot_assay]

Калибруйтесь по аналогичной матрице (кровь, плазма, сыворотка) и процент экстракции будет относительно учтен...

да, именно на сыворотке готовились модельные смеси...

возникает вопрос: может ли в модельной смеси быть достигнута та же степень связывания с белками, что и в организме? (модельные смеси выдерживали от 30 минут до суток - разницы в зависимости от времени инкубации не выявлено)

Сообщение отредактировал hot_assay - 20.02.2012 - 16:58

[hot_assay]

Здравствуйте!
Высокая липофильность способствует образованию довольно прочных "связей" с белками... Когда делали трициклические по Мелентьеву, то эффективность ЖЖЭ составляла от 5 до 15 %.
Калибруйтесь по аналогичной матрице (кровь, плазма, сыворотка) и процент экстракции будет относительно учтен...

у меня получился выход ЖЖ-экстракции клозапина из модельной смеси (сыворотка, инкубация в течение суток) около 30%. Похоже на правду?
Остаётся неясным вопрос о том, одинаково ли связывается клозапин с белками в модельной смеси и реальном объекте...

[D'ng]

Калибруйтесь по аналогичной матрице (кровь, плазма, сыворотка) и процент экстракции будет относительно учтен...

Здравствуйте.
Хотел поинтересоваться... Работаете ли вы со стандартными добавками к анализируемому образцу ?

ПС... Я понимаю , что загруженность лаборатории + стандарты , но все же...

[KSS17]

Здравствуйте!

...
Остаётся неясным вопрос о том, одинаково ли связывается клозапин с белками в модельной смеси и реальном объекте...

Всё будет зависить от содержания белков (альбуминов) в пробе, тут не угадаешь...

...
Хотел поинтересоваться... Работаете ли вы со стандартными добавками к анализируемому образцу ?
...

А как же иначе, в противном случае результат количественного определения вещь в себе.