Здравствуйте, гость ( Вход | Регистрация )

Форум судебных медиков России
 
>

Выделение ДНК из кости

>
Affe04
сообщение 15.03.2012 - 17:55
Сообщение #1


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 29.11.2011
Пользователь №: 30 169


Уважаемые коллеги. При выделении ДНК из б/берцовых и бедренной костей фен.- хлороф. методом. После осаждения этанолом, в 2-х пробах получил необычный осадок в виде прозрачной бесцветной желеобразной массы в количестве около 30 мкл ( кость после варки в МКО) . Во второй пробе - тоже самое, только светло-коричневого цвета. Кость после эксгумации. В земле - не более 5 лет. Такое впервые за много лет. Параллельно выделял кость после эксгумации от другого трупа с тем же сроком нахождения в земле и зуб от 4-го трупа - всё нормально. Во всех случаях, кроме зуба - 72 часа декальцинация. Лизис -около 18 часов с повторным добавлением протеиназы.
"Жидкий" осадок растворяется в воде. Опять залил спиртом и солью - осадок резко помутнел, впечатление, будто там громадное количество ДНК. Оставил на ночь. Помогите разобраться.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Зубр
сообщение 15.03.2012 - 23:07
Сообщение #2


Магистр форума
Group Icon
Группа: Модераторы
Регистрация: 9.04.2007
Пользователь №: 4 766


Цитата(Affe04 @ 15.03.2012 - 18:55)
Уважаемые коллеги. При выделении ДНК из б/берцовых и бедренной костей фен.- хлороф. методом. После осаждения этанолом, в 2-х пробах получил необычный осадок в виде прозрачной бесцветной желеобразной массы в количестве около 30 мкл ( кость после варки в МКО) . Во второй пробе - тоже самое, только светло-коричневого цвета. Кость после эксгумации. В земле - не более 5 лет. Такое впервые за много лет. Параллельно выделял кость после эксгумации от другого трупа с тем же сроком нахождения в земле и зуб от 4-го трупа - всё нормально. Во всех случаях, кроме зуба - 72 часа декальцинация. Лизис -около 18 часов с повторным добавлением протеиназы.
"Жидкий" осадок растворяется в воде. Опять залил спиртом и солью - осадок резко помутнел, впечатление, будто там громадное количество ДНК. Оставил на ночь. Помогите разобраться.

Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Affe04
сообщение 16.03.2012 - 17:31
Сообщение #3


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 29.11.2011
Пользователь №: 30 169


Цитата(Зубр @ 16.03.2012 - 00:07)
Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.


Здравствуйте уважаемый Зубр. После нового переосаждения и ф-х экстракции ни чего не изменилось. Вы правы, осадок ДНК так ни когда не выглядит. Даже из костей. Попробую эти пробы выделить набором АВ на магнитах. И по новой с ф-х. Время терпит. Пробовать генотипирование бесполезно. Осадок ДНК таким не бывает.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Lady
сообщение 16.03.2012 - 19:35
Сообщение #4


Продвинутый участник

Группа: СМЭ
Регистрация: 17.10.2011
Пользователь №: 29 418


Цитата(Зубр @ 15.03.2012 - 23:07)
Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом.

Почему? В чем его преимущество?
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Affe04
сообщение 17.03.2012 - 10:56
Сообщение #5


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 29.11.2011
Пользователь №: 30 169


Цитата(Lady @ 16.03.2012 - 20:35)
Почему? В чем его преимущество?


Важно не этанол, пропанол, метанол... а почему ДНК не села нормальным осадком. Выделял набором АТГ, как обычно. В чём химизм события?
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Зубр
сообщение 17.03.2012 - 23:44
Сообщение #6


Магистр форума
Group Icon
Группа: Модераторы
Регистрация: 9.04.2007
Пользователь №: 4 766


Цитата(Lady @ 16.03.2012 - 20:35)
Почему? В чем его преимущество?

Есть отличия. позволяющие при решении разных задач, применять тот или другой спирт, те или другие соли, но есть и преимущества именно изопропанола. Посмотрите старую статью на сей счёт.
Судебная медицина - Прикрепленный файл  nar1995.pdf ( 407.94 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1282
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Affe04
сообщение 20.03.2012 - 18:25
Сообщение #7


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 29.11.2011
Пользователь №: 30 169


Цитата(Зубр @ 18.03.2012 - 00:44)
Есть отличия. позволяющие при решении разных задач, применять тот или другой спирт, те или другие соли, но есть и преимущества именно изопропанола. Посмотрите старую статью на сей счёт.
Судебная медицина - Прикрепленный файл  nar1995.pdf ( 407.94 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1282


Спасибо за статью. Убедительно. Получил генотипы там, где нормальный осадок. Завтра начну перевыделять Препфайлером. Там изопропанол. Спасибо за консультацию.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Пыхтачок
сообщение 22.06.2012 - 05:43
Сообщение #8


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 22.06.2012
Пользователь №: 33 339


Цитата(Affe04 @ 20.03.2012 - 19:25)
Спасибо за статью. Убедительно. Получил генотипы там, где нормальный осадок. Завтра начну перевыделять Препфайлером. Там изопропанол. Спасибо за консультацию.



Набор реактивов PrepFilerTM Express Forensic DNA Extraction Kit (производства фирмы «Applied Biosystems», США) и система для экстракции ДНК Auto Mate ExpressTM Forensic DNA Extraction System в соответствии с прилагаемой к набору инструкцией. И никаких проблем smile.gif
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
prostochock
сообщение 4.11.2012 - 13:26
Сообщение #9


Претендент

Группа: Участники
Регистрация: 2.11.2012
Из: Саратов
Пользователь №: 34 543


Цитата(Зубр @ 16.03.2012 - 00:07)
Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.
[font=Times New Roman][size=7]
доброго времени суток!
если можете подскажите пожалуйста почему изопропанол?в чем секрет?он ведь и при выделении магнитками тоже используется а не этанол.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием
Affe04
сообщение 13.12.2012 - 18:40
Сообщение #10


Новичок

Группа: Участники
Регистрация: 29.11.2011
Пользователь №: 30 169


Добрый вечер. Все 20 лет использовали этанол. Проходило не всегда. Но, это ф-хл. Теперь по инструкции АВ с изопропанолом. По стоимости - не критично. Зачем изопропанол - м.б. знает кто-то другой. В Маниатисе рекомендован пропанол. И в 90-х годах мы так и делали.
Пользователь offline
К началу страницы
+Ответить с цитированием




- Обратная связь Сейчас: 29.03.2024 - 18:26