[Sone4ka]

Уважаемые доктора, в прилагаемом файле фотография ПААГ с установлением отцовста по 6-и локусам (3 диплекса). Помогите, пожалуйста, решить проблемы под номерами 1,2,3,4,5,6, особенно, под номерами 1,2,3. Как "это" правильно называется, какого "это" генеза и как с "этим" бороться? ДНК выделяем из капиллярной крови, высушенной на стерильной марлевой салфетки.
Буду очень благодарна за советы!

Сообщение отредактировал Sone4ka - 6.09.2012 - 07:59

[smex]

1, 2, 3 - неспецифические ПЦР продукты из-за неправильно
подобранных праймеров, неоптимальных условий ПЦР и др.
4, 5, 6 - плохо почищенные праймеры.

[Sone4ka]

1, 2, 3 - неспецифические ПЦР продукты из-за неправильно
подобранных праймеров, неоптимальных условий ПЦР и др.
4, 5, 6 - плохо почищенные праймеры.

Почему праймеры, а не ДНК? Как бы по-вашему выглядела плохо почищенная ДНК? и что скажете, что в одной экспертизе такого нет, а в другой есть и те же праймеры, из того же пизирька, и условия те же, что при выделени, при постановке ПЦР, при форезе. Может, меняются какие-то нюансы, но не могу понять, что конкретно и когда, мозг сломала. Хочется конкретики, и одинаковых по качесвту экспертиз. Может вы сталкивались с этим?
P.S.нюансы: программа пцр стационарная

[smex]

Читайте книжки про ПЦР и Вам многое откроется.

[Зубр]

Увадаемая 'Sone4ka'!

Почему праймеры, а не ДНК? Как бы по-вашему выглядела плохо почищенная ДНК? и что скажете, что в одной экспертизе такого нет, а в другой есть и те же праймеры, из того же пизирька, и условия те же, что при выделени, при постановке ПЦР, при форезе. Может, меняются какие-то нюансы, но не могу понять, что конкретно и когда, мозг сломала. Хочется конкретики, и одинаковых по качесвту экспертиз. Может вы сталкивались с этим?
P.S.нюансы: программа пцр стационарная

Нюансы - великое дело. При том, что Вы работаете с готовыми наборами и, следовательно, не должны менять требования инструкции к наборам - остаётся только несколько моментов, которые следует проверять (варьировать). 1. Экстракция ДНК, её очистка и степень интактности конечного препарата. 2. Тщательная (RT-PCR) проверка концентрации ДНК и наличия/отсутствия ингибиторов. Далее, действия по инструкции, руководствуясь цифрами и фактами, полученными при анализе готовности ДНК к амплификации (п.1 и п.2).
Честно говоря, полосы наверху меня лично вообще мало смущают. Ну есть они в запредельной для данной системы зоне, и пусть там живут. То, что находится в зоне леддера хотелось бы устранить, скорее всего, снизив вносимое количество ДНК в амплификацию. Также не оптимальная амплификация наблюдается в дорожке, расположенной следующейпосле первых леддеров - вес статтера слишком велик. Ещё - не очень просто разбираться с "половинками" аллелей (дорожка перед последними леддерами). Но тут ничего не попишешь - ПААГ.
Удачи.

[Sone4ka]

Читайте книжки про ПЦР и Вам многое откроется.

Читать книжки необходимо всем, в том числе и Вам не помешало бы. Я просила дать конкретные ответы на конкретные вопросы. Если вы не в состоянии на них ответить, прошу не засорять тему.

[Sone4ka]

Увадаемая 'Sone4ka'!

Нюансы - великое дело. При том, что Вы работаете с готовыми наборами и, следовательно, не должны менять требования инструкции к наборам - остаётся только несколько моментов, которые следует проверять (варьировать). 1. Экстракция ДНК, её очистка и степень интактности конечного препарата. 2. Тщательная (RT-PCR) проверка концентрации ДНК и наличия/отсутствия ингибиторов. Далее, действия по инструкции, руководствуясь цифрами и фактами, полученными при анализе готовности ДНК к амплификации (п.1 и п.2).
Честно говоря, полосы наверху меня лично вообще мало смущают. Ну есть они в запредельной для данной системы зоне, и пусть там живут. То, что находится в зоне леддера хотелось бы устранить, скорее всего, снизив вносимое количество ДНК в амплификацию. Также не оптимальная амплификация наблюдается в дорожке, расположенной следующейпосле первых леддеров - вес статтера слишком велик. Ещё - не очень просто разбираться с "половинками" аллелей (дорожка перед последними леддерами). Но тут ничего не попишешь - ПААГ.
Удачи.

Благодарю, Вас, Уважаемый "Зубр", за ответ. К сожалению, в нашей лаб.нет реал-тайма, концентрацию ДНК мы оцениваем "на глаз" в агарозном геле, а наличие/отсутствие ингибиторов с помощью пробы с контролем, но это в крайнем случае. Количество ДНК в амплификацию варьировали, но при меньшей концентрации аллели в нижней части дорожки после первых леддеров плохо видны, этим диплексы и хуже также варьировали количество циклов. С "половинками" непросто, но поэтому, помимо контроля с одной стороны, мы и ставим "половинку" с другой
С уважением, Sone4ka

[smex]

При том, что Вы работаете с готовыми наборами и, следовательно, не должны менять требования инструкции к наборам - остаётся только несколько моментов, которые следует проверять (варьировать). 1. Экстракция ДНК, её очистка и степень интактности конечного препарата. 2. Тщательная (RT-PCR) проверка концентрации ДНК и наличия/отсутствия ингибиторов. Далее, действия по инструкции, руководствуясь цифрами и фактами, полученными при анализе готовности ДНК к амплификации (п.1 и п.2).
Честно говоря, полосы наверху меня лично вообще мало смущают. Ну есть они в запредельной для данной системы зоне, и пусть там живут. То, что находится в зоне леддера хотелось бы устранить, скорее всего, снизив вносимое количество ДНК в амплификацию. Также не оптимальная амплификация наблюдается в дорожке, расположенной следующейпосле первых леддеров - вес статтера слишком велик. Ещё - не очень просто разбираться с "половинками" аллелей (дорожка перед последними леддерами). Но тут ничего не попишешь - ПААГ.
Удачи.

Я бы не стал идеализировать качество готовых наборов, особенно производимых отечественными производителями, у которых хватило денег и терпения на их регистрацию. Если кто-то скорее
ремесленник, чем творец, он будет слепо соблюдать инструкции к наборам. Но мы то не из таких.
Очевидно, что в обсуждаемом случае качество и количество ДНК приемлемое. Повышение температуры отжига праймеров на 0,5-1 градус и/или добавление магния повысит специфичность реакции и артефакты 1, 2, 3 скорее всего исчезнут или в значительной степени ослабнут.

Сообщение отредактировал Зубр - 9.09.2012 - 22:19

[Sone4ka]

Я бы не стал идеализировать качество готовых наборов, особенно производимых отечественными производителями, у которых хватило денег и терпения на их регистрацию. Если кто-то скорее
ремесленник, чем творец, он будет слепо соблюдать инструкции к наборам. Но мы то не из таких.
Очевидно, что в обсуждаемом случае качество и количество ДНК приемлемое. Повышение температуры отжига праймеров на 0,5-1 градус и/или добавление магния повысит специфичность реакции и артефакты 1, 2, 3 скорее всего исчезнут или в значительной степени ослабнут.

Да, наши наборы далеки от идеала, но, что поделать, если начальство жопится! (извините, ) ) финансировать приобретение зарубежных.
На сколько я помню, чтобы повысить специфичность реакции нужно снизить концентрацию магния а, вот, повысить температуру отжига я попробую, тем более для наших медленных циклеров это лучший вариант

[smex]

Да, наши наборы далеки от идеала, но, что поделать, если начальство жопится! (извините, ) ) финансировать приобретение зарубежных.
На сколько я помню, чтобы повысить специфичность реакции нужно снизить концентрацию магния а, вот, повысить температуру отжига я попробую, тем более для наших медленных циклеров это лучший вариант

Про магний Вы прочитали где или узнали у производителя наборов на Amel, LPL и т.п.? Если последнее, то может подстраховаться и таки прочитать, а то эти производители могут что и попутать. Помню ровно 7 лет назад в чудесном городе Тюмень некто г-н Шил*в и г-н Иван*в начали борьбу за легитимность отечественных наборов, де надо использовать только зарегистрированные и т.д. Централизованно подсадили все скудно финансируемые лаборатории на наборы известного производителя, который продлевает регистрационное удостоверение с мая 2010 года. Такая вот вечная молодость. А вообще советую обратиться к другим производителям реагентов, например ТАПОТИЛИ. Там, помню, проблем с артефактами не было.

[Razum72]

Доброе утро всем коллегам! Уважаемый smex, проблем хватает с обоими наборами, у каждого есть свои и плюсы и минусы, в идеале хорошо, если бы оба набора были бы зарегистрированы и поступали в лаборатории, однако...
С уважением.

[Sone4ka]

Про магний Вы прочитали где или узнали у производителя наборов на Amel, LPL и т.п.? Если последнее, то может подстраховаться и таки прочитать, а то эти производители могут что и попутать. Помню ровно 7 лет назад в чудесном городе Тюмень некто г-н Шил*в и г-н Иван*в начали борьбу за легитимность отечественных наборов, де надо использовать только зарегистрированные и т.д. Централизованно подсадили все скудно финансируемые лаборатории на наборы известного производителя, который продлевает регистрационное удостоверение с мая 2010 года. Такая вот вечная молодость. А вообще советую обратиться к другим производителям реагентов, например ТАПОТИЛИ. Там, помню, проблем с артефактами не было.

Про магний-это общеизвестный факт. Слишком низкая концентрация Mg2+ - низкий выход ПЦР-продукта, слишком высокая – продукты неспецифической амплификации. Маниатиса пролистните. Зайдите, хотя бы на molbiol, почитайте про компоненты пцр смеси, там и статейки есть соответствующие.
А по поводу наборов: мы, вообще-то, уголовную ответственность несем за наши экспертизы, поэтому и делать их абы-какими китами, которых на рынке пруд пруди без регистрационного удостоверения, не хочется.

[smex]

Про магний-это общеизвестный факт. Слишком низкая концентрация Mg2+ - низкий выход ПЦР-продукта, слишком высокая – продукты неспецифической амплификации. Маниатиса пролистните. Зайдите, хотя бы на molbiol, почитайте про компоненты пцр смеси, там и статейки есть соответствующие.
А по поводу наборов: мы, вообще-то, уголовную ответственность несем за наши экспертизы, поэтому и делать их абы-какими китами, которых на рынке пруд пруди без регистрационного удостоверения, не хочется.

Ну вот, с магнием и разобрались. Его добавлять не надо. Я думаю у Вас его и нет. А кто такой Маниатис?
Уголовную ответственность СМЭ несут в любом случае, зарегистрированы наборы или нет. Я, возможно, что-то пропустил, а на наборы, которыми Вы пользуетесь, с какого числа была продлена регистрация после того как она закончилась в мае 2010 года?

[Sone4ka]

Ну вот, с магнием и разобрались. Его добавлять не надо. Я думаю у Вас его и нет. А кто такой Маниатис?
Уголовную ответственность СМЭ несут в любом случае, зарегистрированы наборы или нет. Я, возможно, что-то пропустил, а на наборы, которыми Вы пользуетесь, с какого числа была продлена регистрация после того как она закончилась в мае 2010 года?

В том-то и дело, что в любом случае! поэтому, если не дай бог будет какое судебное разбирательство или банальная проверка, против которой наше начальство бессильно и, вдруг, дойдет дело до того, какими китами мы работаем и почему это не Шиловскими, а какими-то без лицензии, то, извините...посудят и посадят...а сухарики коллеги по моргу носить будут...
За Маниатиса я Вас, вообще, покусать готова! Это азбука практической молекулярной биологии! Основа основ! И Вы ее не читали!
какая разница, с какого продлена регистрация? она же продлена. значит есть.

[smex]

[За Маниатиса я Вас, вообще, покусать готова! Это азбука практической молекулярной биологии! Основа основ! И Вы ее не читали!
какая разница, с какого продлена регистрация? она же продлена. значит есть.[/quote]
Ну, если Вам уже есть 18 ...