[5-ая]

Уважаемые коллеги. В связи с отсутствием опыта по определению карбоксимиоглобина, прошу помочь методикой. Как количественно определить карбоксигемоглобин в мышце (особенно, если она обугленна, крови нет)? Большое спасибо.

[zavlab]

Уважаемые коллеги. В связи с отсутствием опыта по определению карбоксимиоглобина, прошу помочь методикой. Как количественно определить карбоксигемоглобин в мышце (особенно, если она обугленна, крови нет)? Большое спасибо.

В обугленной спектрофотометрически никак, методика работает только на негорелых мышцах.

[5-ая]

Да, пробовала горелую мышцу исследовать как кровь, выходят не те показатели экстинции. Негорелую мышцу "настаивали" в растворе аммиаке сутки, дальше обрабатывали как кровь, то же не получилось. Методики у нас нет. Наши говорят:" им до этого не отправляли мышцу". А методичка по определению карбоксигемоглобина и карбоксимиоглобина найти не могут. Помогите, пожалуйста.

[колючка]

Уважаемые коллеги. В связи с отсутствием опыта по определению карбоксимиоглобина, прошу помочь методикой. Как количественно определить карбоксигемоглобин в мышце (особенно, если она обугленна, крови нет)? Большое спасибо.

"Микрометод количественного определения карбоксигемоглобина и карбоксимиоглобина в трупном материале" Г.А. Шаталина, Т.Е. Воронцова....сборник "Вопросы судебно-медицинской экспертизы и криминалистики", Горький , 1979 год стр. 117-121

[Djer]

Уважаемый коллега, имею опыт работы по определению карбоксимиоглобина. Несколько советов: 1. Если мышца поступила с видом «вареного мяса», конечно определить карбоксимиоглобин будет не возможно. В этом случае следует в заключении написать, что «…в связи с термическим воздействием высокой температуры определить карбоксимиоглобин не представляется возможным…».
2. В выше указанном случае суд.мед. эксперт должен на исследование направлять «кость грудины», в которой можно будет исследовать костный мозг. Так как при высокой температуре сохраняется - HbCO, который там можно будет определить. Проверено сотни раз. Что касается методики – я ее Вам высылаю. Правда в ней есть неточности которые следует устранить. Найдите по тексту - «Надосадочную жидкость сливают и к декантированной жидко¬сти прибавляют смесь фосфатов натрия (на 10 мл жидкости прибавляют 0,1 г смеси).». Следует прибавлять не 0,1 г смеси фосфатов, а 0,3 г, а может и больше (смесь фосфатов прибавляют для осаждения избытка ацетата свинца). Если этого не сделать, то при добавлении в кювету дитионита, раствор станет мутным, и Вы не сможете определить плотность раствора (D). У Вас все получится, если все будете делать тщательно и аккуратно. Методика проверена сотни раз. Желаю удачи.

[Медик]

«кость грудины», в которой можно будет исследовать костный мозг.

А возможно ли выделить НbСО из костного мозга диафиза бедренной кости или же из костного мозга другой плоской кости (но не грудины),к примеру подвздошной ?

[D'ng]

2. В выше указанном случае суд.мед. эксперт должен на исследование направлять «кость грудины», в которой можно будет исследовать костный мозг. Так как при высокой температуре сохраняется - HbCO, который там можно будет определить. Проверено сотни раз.

Ув. Djer Интересно знать как потом интерпретировать полученный результат ?

И по поводу методики (пробежал не вчитываясь)... В списке реагентов бросилась в глаза приписка от руки-Na2S2O4. Вы таки пользуетесь гидросульфитом (NaHSO3) или дитионитом (Na2S2O4) ? В принципе нужна лишь восстановительная среда , но...

Ув. Медик костный мозг это последнее , что лично я бы рассматривал как объект для количественного определения карбокси.
Во первых - интерпретация результатов (особенно случае быстро наступившей/мгновенной смерти) это вилами по воде.
Во вторых - если нельзя взять кровь или мышцу то кость (с сильно обгоревшего трупа) брать смысла тоже нет...

[Djer]

Уважаемый Медик, конечно можно, т.к. красный костный мозг содержится в ячейках губчатого вещества плоских костей (грудина, крылья подвздошных костей), в губчатых костях и эпифизах трубчатых костей. Для определения HbCO следует изъять костный мозг, а лучше всего для этого подходит грудина, в ней больше красного костного мозга, с ней проще работать – она мягче. И еще, штатное вскрытие начинается с вскрытия грудной клетки, и мало кто из экспертов будет делать « лишнюю работу».

[Djer]

Уважаемый D’nq, дитионит является очень сильным восстановителем по сравнению гидросульфидом. Еще в конце 70 – х годах прошлого века, когда апробировали методики на карбокси, пришли к выводу, что лучше дитионита для определения HbCO ничего нет.
Теперь, что касается интерпретации полученного результата. Не судебному химику его решать. Т.к., Вам будет поставлен вопрос – Обнаружен или не обнаружен карбоксигемоглобин (карбоксимиоглобин). А вот суд.медэксперту будут поставлены следствием конечно другие вопросы. Если карбоксигемоглобин не был обнаружен в костной ткани это говорит о том, что он был мёртв до пожара и т.д и т.п. Концентрация в карбоксигемоглобина в костной ткани коррелирует с концентрацией карбоксигемоглобина в крови.

[D'ng]

Ув. Djer
По поводу восстановителя. Вы сами в перечисленных неточностях это не отметили. Кроме того не однократно сталкивался с тем , что дитионит называли гидросульфитом.

ПС... знаю пределы компетенции судебного химика в России и их не обсуждаю.
По поводу корреляции концентрации карбокси в костной ткани с концентрацией в крови - в каких пределах коррелирует (обнаружено/нет) или вы даете количественное содержание ?

[Медик]

лучше всего для этого подходит грудина

Понял.
1.Каких размеров должен быть кусок грудины?
2.Определения НbСО количественное?
3.Есть ли смысл брать кусок грудины гнилостно изменённого трупа ?

Сообщение отредактировал Медик - 24.11.2013 - 12:51

[chemist-sib]

...Определения НbСО количественное?

За очень редким исключением, есть удается "поймать" HbCO в таких "нетрадиционных" объектах, то - да, его определяют количественно. Про размеры - ничего не скажу, бо "в руках не вертел". Собственно, оттуда надо добыть "жмень" красного мозга... А вот про гнилостность - если только ДНС не исчисляется месяцами-годами - так это помеха не столь большая; CОHb - вещество, достаточно стойкое, в т.ч. и к гниению (в этом я Бережному и своему опыту верю).

[chemist-sib]

Отдавая себе отчет, что разговор несколько ушел от заявленной в заголовке темы на другую, хоть и "близкородственную", тем не менее продолжу его - ибо интерес к вопросу наличествует.
Вот некоторый фактический материал по определению карбоксигемоглобина в костной ткани.

Бабаханян Р.В., Бородавко В.К., Петров Л.В. Определение карбоксигемоглобина в костном мозге. - Суд.-мед. эксперт., 1987, № 3, с.50 -51.
Бабаханян Р.В., Бусова Н.С. Методика спектрофотометрического определения карбоксигемоглобина в костном мозге. - В кн.: Сб. научных трудов "Лабораторная диагностика на службе судебной медицины", Харьков, 1985, с.155-156.

Пробоподготовка и там, и там – одинаковая. Грудину (либо фрагмент крыла подвздошной и бедренной кисти) очищали от мягких тканей и распиливали по средней линии. Костный мозг выдавливали при помощи пресса или тисков (а из бедренной кости выскабливали при помощи глазной ложки). К полученной порции костного мозга добавляли хлороформ в соотношении 1:5, тщательно перемешивали в течение 1-2 минут и центрифугировали. 1 мл обезжиренного костного мозга смешивали с 50 мл дистиллированной воды и оставляли на 1-1,5 часа в темном месте при комнатной температуре, затем вновь центрифугировали – подольше и пооборотистей. К 40 мл надосадочной жидкости приливали 1,6 мл 25% раствора аммиака (ИМХО! – многовато. До конечной концентрации 0,1%, привычной химикам, нужно ровно в 10 раз меньше! Но так, дословно - в обеих статьях). В этом прозрачном растворе определяли COHb либо по методике Гладышевской (1974), либо по методике Букиной и Ушаковой (1979). При параллельном определении карбоксигемоглобина в разных объектах концентрация его в костном мозге была ниже на 15-30% (по другому источнику – на 30-40%), чем в крови. Но в случаях смерти от заведомого отравления СО в костном мозге удавалось определить от 10 до 67% карбоксигемоглобина. Достоверно определяемая минимальная концентрация карбоксигемоглобина составила 10%; величина ошибки в интервале концентраций от 10 до 20% составила ±3%, при концентрации его свыше 20% была ±7% (правда, являются ли эти проценты погрешности "абсолютными" или относительными - ничего сказать не могу... Короче, будем считать, что точность определения приблизительно такая же, как и в цельной крови ).

[D'ng]

Здравствуйте.
Мысли в слух...
Во первых для обезжиривания лично я с успехом применял н-гексан-хлороформ , а сей час фреон-гексан предпочитаю , а не хлороформ.
Во вторых для обезжиренной ткани лучше брать не чистую воду , а если методика позволяет то беру смеси вода-этанол/метанол , а если экстракция жиров не полная то вода-изопропанол.
Это в общем , а по существу...

Заниженное , по отношению к крови , содержание карбокси обусловлено не только самой методикой.
Хотя если попробуете взять кровь с известным содержанием карбокси , добавить любой жир и проанализировать в соответствии с приведенной методикой то получите даже больший разброс , нежели указанный (занижение на 15-40 %).

Про концентрацию 67% карбокси в костном мозге НЕ ВЕРЮ !!! Но тут вопрос а как пересчитывается ?
Про минимальную концентрацию 10% совсем не понял...


Ув. Сhemist-sib на основании чего приравниваете точность обсуждаемой методики к точности определения карбокси в цельной крови ?

[chemist-sib]

Доброго времени суток, коллеги! Сразу извиняюсь за «многА букоФФ», но никак короче не получается.
Пытаться объяснить то, что не ты сам, а некие посторонние авторы - либо не смогли, либо не захотели описывать собственными руками и в своих собственных статьях - дело не очень благодарное. К тому же я честно сознаюсь - вот так, полностью следуя букве упомянутых выше методик, я никогда и не работал. Поэтому могу судить о них лишь с позиций "банальной эрудиции" (как обычно говорит наш коллега КSS17), либо по опыту использования лишь отдельных приемов и элементов. Короче - вижу перед собой те же буквы, что и другие, читающие эти статьи Именно поэтому честно начал со ссылок. Прицепил бы и сканы этих статей, да сканера у меня нету. Вот и приходится «сканировать» собственными «глазками, да ручками…», где-то – дословно, где-то – конспективно, пытаясь отделить авторское от моих к тому комментариев.
Про использование других растворителей: наверное, можно. Вполне возможно, что есть и более эффективные и удобные, чем описанный хлороформ. Авторы ведь не уточняют - по каким именно экспериментальным критериям (или умозрительным соображениям) они его выбрали. Может быть, просто потому, что для судебного химика (особенно того времени) он - самый-самый привычный? Просто дотянуться рукой до ближайшей склянки? А если бы я пытался обосновать выбор растворителя, я бы учитывал: 1) способность его растворять среднеполярные в-ва (липиды, фосфолипиды) - следовательно, он сам должен среднеполярным (т.е., тот же хлороформ, а если и углеводороды, то в смеси с чем-то существенно более полярным); 2) малую остаточную растворимость его в воде (чтобы потом гарантированно не мешался в конечном фотометрируемом растворе, не «мутил воду»); 3) отсутствие денатурирующего влияния на белки, в частности, на дериваты гемоглобина (чем, например,"грешат" низшие спирты и кетоны); 4) отсутствие окислительного действия на гемоглобин и его дериваты (а также типичных примесей, обладающих таким действием); 5) удобство отбора верхней (или нижней) фазы, а также легкость разделения неизбежно образующейся дисперсной системы; ... Список можно продолжать. Но авторы проверяли только один хлороформ. Проверили. Получилось. Если у кого-то будет использоваться другая система для достижения того же результата, и это тоже проверится - ничего не имею против. Хотя я вообще никогда ничего не имею против того, что каждый сознательный индивидуум делает в границах своей собственной «зоны ответственности». В данном же случае потому, что это - не критично (ИМХО!).
Про заниженную концентрацию. Ничего не могу сказать, как вела бы себя кровь, если к ней «сверху» добавляли жир - ибо руками сам так никогда не проверял. Опять - только "банальная логика": полагаю, что истинная концентрация карбоксигемоглобина никак бы не изменилась, но - если только фотометрируемый раствор крови был бы приготовлен правильно, т.е. без дополнительной мути, обусловленной как раз этим самым жиром. А для этого, конечно, надо производить дополнительные телодвижения - центрифугировать, фильтровать, причем, выбирая - до гемолиза в растворе аммиака это делать, или после... Проверять и перепроверять получаемые собственные результаты, пользуясь разными методами, разными участками спектров... А вот если этого не делать, тогда, наверное, и будут "скакать" результаты. Только вот разброс их (т.е., бОльшая случайная погрешность измерения) и занижение (или завышение - не суть важно, т.е. погрешность систематическая, методическая, с соответствующим знаком) - это ж вещи совершенно разные.
Про природу этого занижения. Опять - только ИМХО: наверное, потому, что объект этот (костный мозг) находится глубже в организме и массообмен дериватов гемоглобина с кровью периферической - затруднен. Запаздывает динамика роста концентрации карбоксигемоглобина, по сравнению с остальной кровью. Но одновременно эта «удаленность» объекта и позволяет дериватам гемоглобина остаться в некоторых случаях неденатурированными, когда все вокруг варится, спекается, сохнет, гниет… А поскольку речь все же идет о системе гемоглобин-оксигемоглобин-карбоксигемоглобин, то правомочность применения градуировки, полученной на цельной крови, у меня особых сомнений не вызывает. Но это все – при правильной пробоподготовке и прозрачных конечных растворах. Мимоходом замечу, что и работая только с банальной цельной кровью, нельзя исключить, что тебе не попадется особо пакостная, жирная, гнилая… А вот для того, чтобы получаемые в подобных (да в любых!) случаях цифры концентраций не вызывали никаких сомнений не только у самого эксперта, но и всех получателей (и проверятелей) его результатов, подход к подобным исследованиям должен быть именно судебно-химический: качественное обнаружение (несколькими независимыми методами), и только потом – количественное определение, и если оно – спектральное – то обязательный критический анализ спектра (для объективного подтверждения возможности использования самого метода) и проверка-перепроверка получаемых результатов по нескольким участкам спектра. А не просто – по судебно-биохимически – один-два-три замера оптических плотностей, одна расчетная формула – и «получите!»… Зачастую – непонятно что, но – быстро!
По поводу точности. Говоря о том, что я не понимаю, какие проценты имели в виду авторы статей, я-то имел в виду (извините за эту тавтологию!), скажем, для 30% результата конечный интервал (30 ± 7)% или, считая 7% от этих 30, (30 ± 2)%? Вот такая неоднозначность написания… А говорил о том, что точность определения COHb в костном мозге сопоставима с точностью определения в цельной крови, помятуя один из выводов в статье Букиной и Ушаковой, дословно: «Обе методики (авторская и Гладышевской – c.-s.) не позволяют определять количественное содержание карбоксигемоглобина с погрешностью меньше 5%». Впрочем, с этими процентами – ровно такие же непонятки. Короче – где-то приблизительно одинаково (тем более, что само определение – одинаково абсолютно)…
Мне всегда нравилось сравнение судебно-химического исследования с игрой в шахматы: есть некая общая идеология, общие подходы. Но конкретные ходы могут быть совершенно разными. Не всегда «пешка е2-е3» - это заведомо хуже, чем «кривые прыжки» коня. Главное – чтобы в результате всего это была победа. Успехов всем!