[sch1sm]

Скажите есть ли какая нибудь разница между глюкуронидазами helix pomatia и e.coli, при использовании в токс анализе мочи?

[Deminolog]

Поправьте, если совру - фермент виноградной улитки - это арилсульфотаза, а глукурониды полностью расщепляет фермент E.coli... Сейчас в голове небольшая каша, так что лучше дождаться еще мнений :-)

[KSS17]

Здравствуйте!
Нет. Улитка даёт смесь глюкоуронидазы с арилсульфотазой. Коли только глюкуронидаза. Первое предпочтительнее.

[zavlab]

Здравствуйте. Впервые столкнулись с β-глюкуронидазой. приобрели сигмовскую из Escherichia coli тип IX-A G7396-25KU. Доставлена в термоконтейнере с холодовыми аккумуляторами, замороженная. Претензий нет. Развел в буфере 75 мМ фосфатном рН 6,8, Решил проверить, в паспорте субстрат для проверки- глюкуронид фенолфталеина, такого естественно нет. Взял пробу мочи с опиатами, 1 ч -кислотный гидролиз, 1 ч - ферментный, 1 ч -просто экстракция. Для простоты и наглядности использовал ТСХ. Результат- в кислотном отличный морфин, с глюкуронидазой следы, как в пробе без гидролиза.
Повторял с большей температурой, выдержку увеличивал до 4 часов, увеличивал количество фермента - результат нулевой. Вероятно фермент в мусор. Возможно на таможне разморозился, а фирма потом заморозила и нам привезла.

[sch1sm]

пользовался поматией и коли, у них разный был процесс активации, но все работало, модет вы их не додержали в термостате при активации?

[KSS17]

Здравствуйте!

Здравствуйте. Впервые столкнулись с β-глюкуронидазой. приобрели сигмовскую из Escherichia coli тип IX-A G7396-25KU. Доставлена в термоконтейнере с холодовыми аккумуляторами, замороженная. Претензий нет. Развел в буфере 75 мМ фосфатном рН 6,8, Решил проверить, в паспорте субстрат для проверки- глюкуронид фенолфталеина, такого естественно нет. Взял пробу мочи с опиатами, 1 ч -кислотный гидролиз, 1 ч - ферментный, 1 ч -просто экстракция. Для простоты и наглядности использовал ТСХ. Результат- в кислотном отличный морфин, с глюкуронидазой следы, как в пробе без гидролиза.
Повторял с большей температурой, выдержку увеличивал до 4 часов, увеличивал количество фермента - результат нулевой. Вероятно фермент в мусор. Возможно на таможне разморозился, а фирма потом заморозила и нам привезла.

Глюкоуронидаза от Коли работает только в отношении глюкоуронидов, и никак не влияет на сульфаты.
Ферментативный гидролиз дело не быстрое и 1 часа явно недостаточно. У нас 2,5 тыс Ед на 0,5 мл мочи 2 часа при 45 гр. С. Посмотрите аннотации на продукт, обычно в Сигме указан стандартный подход.
Сколько грамм/Ед брали для пробы?

Сообщение отредактировал KSS17 - 10.02.2016 - 15:34

[zavlab]

Здравствуйте!

Глюкоуронидаза от Коли работает только в отношении глюкоуронидов, и никак не влияет на сульфаты.
Ферментативный гидролиз дело не быстрое и 1 часа явно недостаточно. У нас 2,5 тыс Ед на 0,5 мл мочи 2 часа при 45 гр. С. Посмотрите аннотации на продукт, обычно в Сигме указан стандартный подход.
Сколько грамм/Ед брали для пробы?

Спасибо за внимание. Во флаконе 36мг вещества с активностью 694300 ед/г, или 1234531 ед/г белка,реконструировал в 7 мл буфера (раствор хранил в морозильнике), соответственно 25000ед в растворе, 3570 ед/мл готового раствора, начинал от 140 ед (40 мкл) на 2 мл мочи в итоге дошел до 1 мл (3570 ед), последний раз инкубировал 4 часа с 1 мл.

[chemist-sib]

Коллегаb zavlab, и даже с таким максимальным количеством фермента и времени - результаты хреновые?

[zavlab]

Нулевые, у меня только 1 версия - фермент умер.

[KSS17]

Здравствуйте!
Водные растворы ферментов замораживать не хорошо.
Я правильно понял, что отдали 7 тыров за 36 мг?
Если так много денег берите из улитки готовый 100000 ед/мл (ещё и ароилсульфатаза имеется), 25 мкл на 0,5 мл мочи и работает. Брали поначалу по 1 мл, перешли на 2 мл (12 тыров), сейчас уже берем по 5 мл (23 тыра). Нам конечно чуть дороже заматывают поставщики...

[zavlab]

Здравствуйте!
Водные растворы ферментов замораживать не хорошо.
Я правильно понял, что отдали 7 тыров за 36 мг?
Если так много денег берите из улитки готовый 100000 ед/мл (ещё и ароилсульфатаза имеется), 25 мкл на 0,5 мл мочи и работает. Брали поначалу по 1 мл, перешли на 2 мл (12 тыров), сейчас уже берем по 5 мл (23 тыра). Нам конечно чуть дороже заматывают поставщики...

Нет, я про цену не писал, даже и не знаю ее. Попробую купить из улитки. Всем спасибо за помощь.

[posett]

Нет, я про цену не писал, даже и не знаю ее. Попробую купить из улитки. Всем спасибо за помощь.

Доброго дня всем! Я не судебный медик, но хотел бы помочь разобраться в разных видах продукции Сигма. В каталоге имеются несколько видов ферментов из разных источников, с разными характеристиками по ферментативной активности (см. 1 и 2 рис.)

Из графиков видно, что самыми эффективным являются ферменты из морских блюдечек limpets (артикул G8132), при низких концентрациях раствора на втором месте идут ферменты из морских ушек (артикул SRE0038), при высоких концентрациях ферменты из улитки (артикул G7017), однако ферменты улитки при длительном ферментации 3-4 часа теряют активность, что влияет на степень разложения. Ферменты E-Coli лучше вообще не использовать.
Теперь что касается экономики - самым оптимальным по характеристикам и цене является фермент из морских ушек, т.к. он вдвое дешевле улитки и морских блюдечек. Артикулы раствор SRE0037/лиофилизат SRE0038. Сух вещество не испортиться при транспортировке, т.к. транспортируются при 2-8 град (не путать с хранением -20), оно выгоднее чем раствор, больше срок хранения.
Спасибо за внимание.