Здравствуйте, гость ( Вход | Регистрация )
Способ выделения ДНК из гистопрепаратов. |
sasa_vz |
25.09.2015 - 21:59
Сообщение
#1 |
Авторитетный участник Группа: СМЭ Регистрация: 9.02.2007 Из: Ивановская обл. Пользователь №: 4 362 |
Уважаемые коллеги! Каким способом лучше всего выделять ДНК из фиксированных тканей, залитых в парафиновые блоки?
|
доктор морфолог |
26.09.2015 - 16:50
Сообщение
#2 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
Уважаемые коллеги! Каким способом лучше всего выделять ДНК из фиксированных тканей, залитых в парафиновые блоки? Есть метод разработанный ФГУ РНЦПХТ(RU 2351632). Из парафиновых блоков делают срезы толщиной 20 мкм. К срезу добав.100мкл 0,5%вод.р-р Твин20, затем смест нагревают при +90С в теч.15мин.далее добав.50мкл.протеиназы К при+55С и ежечасно взбалтываем,после этого добавляют реагенты: 100мкл 5%водн.раствор Челекс100 и по 5 мкл водн.р-ры 0,5 М Трис с РН 8,0 и 1М ЭДТА С РН 8,0 и нагреваем до+ 100С в теч.15 мин.и полученный р-р центрифугируем при 10500об/мин.Затем охлаждаем при t-1С в теч.5 мин. Затем удаляем застывший слой парафина стерильным наконечником, остатки нагреваем с хлороформом при t+45C, затем центрифугируем при 10500 об/мин.в теч.15 мин., 200мкл.супернатанта перенесли в стерильн.пробирку+добав.к нему 5мкл.5М водного р-ра хлористого натрия + 500 мкл абсолют.этил.спирта.после этого центрифугируем при 10500об/мин.в теч.30 мин.при t +4C и верхний слой удаляем, а к осадку добавляют 100мкл 80% этил.спирта. И вновь центрофуируем при 10000об/мин.при t+4C, заткм верхний слой удаляют , а нижний слой высушивают при t +65C в теч.10 мин.Затем растворяют его в 30мкл в бидистмлиров.воде И этот раствор используют дляПЦР т.к.раствор содержит ДНК..На электрофорезе в агарозном поле обнаружены амплифицированные фрагменты соответствующих размеров от90 и 200 нуклеотидов соответственно, чио зарактеризуют высоко качество ДНК.И имееь преимушество в 1,5 и 2 раза чем в прототипе)И обеспечивает высокии выход качественного ДНК.И получены из всех 100%срезов. Ныне ни один известные методы в мире так не обеспечивает выход ДНК для ПЦР. Способ разработан ФГУРНЦРХТ( RU) |
sasa_vz |
26.09.2015 - 21:37
Сообщение
#3 |
Авторитетный участник Группа: СМЭ Регистрация: 9.02.2007 Из: Ивановская обл. Пользователь №: 4 362 |
Огромное спасибо!!!
P.S. Сам ничего не понял, но жена сказала, что так и должно быть, потому что генетик она, а я так - медкрим ... |
доктор морфолог |
27.09.2015 - 09:25
Сообщение
#4 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
Огромное спасибо!!! P.S. Сам ничего не понял, но жена сказала, что так и должно быть, потому что генетик она, а я так - медкрим ... Я гистолог...смотрю никто 2 дня не реагирует..специально для общего дела листал все и нашел у Великой России у Россиских ученых в ФГУ РНЦПХТ. С ув. |
Venerdi |
27.09.2015 - 12:53
Сообщение
#5 |
Новичок Группа: Участники Регистрация: 12.04.2015 Пользователь №: 41 775 |
Я гистолог...смотрю никто 2 дня не реагирует..специально для общего дела листал все и нашел у Великой России у Россиских ученых в ФГУ РНЦПХТ. С ув. А Prepfiler с предварительной обработкой ксилолом хуже работает? Сама не пробовала, но говорят, что Днк выделяется в достаточном количестве. |
доктор морфолог |
27.09.2015 - 15:25
Сообщение
#6 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
А Prepfiler с предварительной обработкой ксилолом хуже работает? Сама не пробовала, но говорят, что Днк выделяется в достаточном количестве. Другими известными методами выделение ДНК где то 63 %выделялись.т.к.гистопроводка проводится в основном на этил.спирте разной концентрации и хлороформе и ксилоле, которые могут фрагментировать молекул ДНК..с учетом этих минусов ФГУ РНЦПХТ RU при исследовании по онкомаркерам для ПЦР по опухолям простаты ,разработали и запотентовали вышеуказанную методику. |
Venerdi |
27.09.2015 - 20:33
Сообщение
#7 |
Новичок Группа: Участники Регистрация: 12.04.2015 Пользователь №: 41 775 |
Другими известными методами выделение ДНК где то 63 %выделялись.т.к.гистопроводка проводится в основном на этил.спирте разной концентрации и хлороформе и ксилоле, которые могут фрагментировать молекул ДНК..с учетом этих минусов ФГУ РНЦПХТ RU при исследовании по онкомаркерам для ПЦР по опухолям простаты ,разработали и запотентовали вышеуказанную методику. Спасибо! А как приготовить 0,5% р-р твин 20? |
Медик |
27.09.2015 - 20:42
Сообщение
#8 |
Учитель Группа: Модераторы Регистрация: 16.05.2010 Пользователь №: 21 553 |
|
genosys |
27.09.2015 - 21:07
Сообщение
#9 |
Опытный участник Группа: Участники Регистрация: 2.08.2011 Пользователь №: 28 146 |
В РФ наркоконтроль запретил. Это всерьез что-ли? В лабраториях нельзя хлороформ использовать?? Вот Qiagen с Zymo и Ко образуются, все на колонки перейдут @ТС Кстати, можете посмотреть сайты названных производителей, у них полно китов для выделения из FFPE, по отзывам очень неплохо работающих. Российский Evrogen также похожие выпускает. |
доктор морфолог |
27.09.2015 - 21:20
Сообщение
#10 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
В РФ наркоконтроль запретил. Возможно, перешли на изопропиловый спирт, где заменяет этил.спирт и хлороформ с прибавкой поверхностно активных веществ кажется. Это всерьез что-ли? В лабраториях нельзя хлороформ использовать?? Вот Qiagen с Zymo и Ко образуются, все на колонки перейдут @ТС Кстати, можете посмотреть сайты названных производителей, у них полно китов для выделения из FFPE, по отзывам очень неплохо работающих. Российский Evrogen также похожие выпускает. Эти киты не по карманам возможно...А хлороформ еще использует, где нужно. |
genosys |
27.09.2015 - 21:24
Сообщение
#11 |
Опытный участник Группа: Участники Регистрация: 2.08.2011 Пользователь №: 28 146 |
Возможно, перешли на изопропиловый спирт, где заменяет этил.спирт и хлороформ с прибавкой поверхностно активных веществ кажется. Ув. Доктор, Вам конечно простительно быть не в курсе как не генетику, но большинство классических молбиол протоколов предполагает использование хлороформа для выделения нукл. кислот. Как без него обходится, если на колонки нет денег, я вообще не представляю... |
Медик |
27.09.2015 - 21:51
Сообщение
#12 |
Учитель Группа: Модераторы Регистрация: 16.05.2010 Пользователь №: 21 553 |
хлороформ Заменили на ксилол. В лабраториях нельзя хлороформ использовать?? В гист.-запрет.У начальства есть бумаги на это счёт.Точно не помню,но 2 или 3 года без хлороформа гист.проводка. Это всерьез что-ли? Да. |
genosys |
27.09.2015 - 21:54
Сообщение
#13 |
Опытный участник Группа: Участники Регистрация: 2.08.2011 Пользователь №: 28 146 |
Заменили на ксилол. В гист.-запрет.У начальства есть бумаги на это счёт.Точно не помню,но 2 или 3 года без хлороформа гист.проводка. Ну, для депарафинизации хлороформ не очень-то и нужен, достаточно ксилола и спирта, по кр. мере при выделении ДНК. Хлороформ нужен чтобы от фенола избавляться в других протоколах. |
доктор морфолог |
27.09.2015 - 22:01
Сообщение
#14 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
Ув.Медик, у нас как то хлороформ был в списке прекурсоров, но в последние лет 5 у нас приказах снято. Мы то от РФ все берем ...же.
Ув.genosys, я понял Вас. Я на счет гистпроводки имел ввиду. А так для выделения ДНК да много чего нужно для рутинной работы и качественного и количественного выделения ДНК... Ув.ТС кажется Твин 20 готовые импортные есть ... |
доктор морфолог |
28.09.2015 - 04:21
Сообщение
#15 |
Мастер I Группа: СМЭ Регистрация: 5.12.2013 Пользователь №: 38 421 |
Ув. Доктор, Вам конечно простительно быть не в курсе как не генетику, но большинство классических молбиол протоколов предполагает использование хлороформа для выделения нукл. кислот. Как без него обходится, если на колонки нет денег, я вообще не представляю... Спасибо Вам за подсказку. Хлороформ нужен и для гистопроводки для депарафинизации и для генетиков для выделения Нуклеокислот...т.к.хорошо разрушает мембрану клеток и раздражительно действует на молекулу ДНК....т.е.может фрагментировать ядер клеток и т.д.... |
Сейчас: 28.03.2024 - 23:30 |