[Дмитрий]

Иммунологические методики в комплексном анализе микрообъектов судебно-биологической экспертизы



Категория: Авторефераты диссертаций
Библиографическое описание:
Александрова Вера Юрьевна
Аннотация:
Иммунологические методики в комплексном анализе микрообъектов судебно-биологической экспертизы. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, 14.00.24 – "Судебная медицина". - Москва, 2008 г.
Работа выполнена в Институте Криминалистики Центра специальной техники ФСБ России. Научный руководитель - доктор медицинских наук Лапенков Михаил Иванович. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Жаров Владимир Васильевич,кандидат медицинских наук, доцент Колоколова Галина Петровна. Ведущее учреждение - ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия».
Актуальность проблемы.
Получение криминалистически значимой информации при анализе следов биологического происхождения представляет собой сложную задачу, требующую применения различных методов. В настоящее время наиболее доказательными являются молекулярно-генетические исследования (МГИ). Их значение в практике судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств (СМЭВД) трудно переоценить. Однако ставшие давно классическими различные иммунологические методы все еще широко применяются. Их использование обусловлено рядом факторов. В частности, определение групповой принадлежности по системе АВО позволяет, во-первых, дифференцировать поступающие на исследование объекты и биологические образцы от конкретных лиц; во-вторых, получать разыскные сведения. Кроме того, при исследовании объектов, МГИ которых невозможно или затруднено вследствие отсутствия или недостаточного количества ДНК, только иммунологические методы могут предоставить информацию, которая в случае исключающего вывода носит доказательный характер. Немаловажным фактором является также низкая стоимость иммунохимических исследований.
В настоящее время для выполнения каждого вида анализа в большинстве судебно-медицинских лабораторий используется отдельная часть исследуемого объекта. При этом экспертами, выполняющими какой-либо вид биологических исследований, не учитываются потребности и особенности проведения иных видов анализа. Такой подход может быть допустим при наличии биологического материала в достаточном количестве. Однако следы крови, выделений и тканей человека, выявляемые на различных предметах, часто имеют малую величину. В таких случаях при назначении первичной биологической экспертизы, а уже затем дополнительной - молекулярно-генетической, для более информативных МГИ может просто не хватить биологического материала. С другой стороны, проведение только генетических исследований микрообъектов не всегда целесообразно, так как при получении отрицательного результата остается открытым вопрос, чем это вызвано: деградацией ДНК, потерей материала во время пробоподготовки или исследованием объекта, происходящего не от человека.
При исследовании микрообъектов необходим комплексный подход, который предполагает параллельное или последовательное исследование биологического материала различными специалистами по заранее выработанной схеме с последующим анализом полученных данных и формулированием совместных выводов.
Идея использования одного экстракта для разрешения нескольких вопросов, поставленных перед экспертом, появилась в 60-е годы прошлого века (A. Fiori, 1963). В 1982 году во Всесоюзном НИИ МВД СССР были разработаны «комплексированные» методики анализа микроследов крови, которые предусматривали раздельное исследование осадка и надосадочной жидкости экстракта из пятна крови, а также фиксированных компонентов следа на предмете-носителе (М.А. Бронникова, М.В. Кисин, Т.В. Стегнова, 1982). Что касается комплексных исследований выделений человека, то в доступной нам литературе встретилась только одна статья (H. Noda et al., 2002), авторы которой предлагают раздельно исследовать клетки цитологическим и иммуногистохимическим методами, а жидкую часть слюны иммуноферментным методом.
Создание такой схемы, которая обеспечивала бы оптимальное распределение анализируемого материала для каждой методики в соответствии с криминалистической значимостью получаемых данных, является важной задачей.
В связи с внедрением в экспертную практику генотипирования, следует определить роль и место иммунологических методов в комплексном анализе объектов судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств (СМЭВД). Как справедливо указывают П.Л. Иванов и В.А. Клевно (2008), «…центр тяжести переместится именно на молекулярно-генетические технологии… Все другие востребованные методические составляющие судебно-медицинской биологии при этом также будут применяться, но в качестве вспомогательных и дополняющих». Соответственно, иммунологические методы, кроме выполнения своих традиционных задач, таких как установление наличия биологического материала, видовой и групповой принадлежности, должны применяться в качестве скрининга для отбора объектов с целью более успешного проведения в последующем МГИ.
Для осуществления такого подхода необходимо признать разделение судебно-биологической и молекулярно-генетической экспертизы искусственным явлением. «Судебно-биологические отделения должны стать экспертными подразделениями нового типа, отвечающими за комплексное исследование вещественных доказательств» (П.Л. Иванов, В.А Клевно, 2008). В противном случае при поступлении на исследование микрообъектов теряется часть поисковой информации, а также могут быть зря израсходованы дорогостоящие реактивы и непроизводительно затрачено время эксперта.
В связи с изменившейся ролью классических иммунологических исследований изменились и требования к их проведению. Поскольку данные методы предлагается использовать на первых стадиях экспертизы, они должны быть применены так, чтобы обеспечить сохранение ДНК-содержащего материала для дальнейших МГИ. Например, установление наличия крови и выделений путём выявления гемоглобина, простатоспецифического антигена, амилазы предпочтительно проводить, исследуя надосадочную жидкость. Групповую принадлежность также желательно устанавливать по той части биологического материала, которая непригодна для генотипирования. Сохранности биологического материала для дальнейших исследований способствует внедрение методик, обладающих высокой чувствительностью или носящих недеструктивный характер.
Кроме того, поскольку основные силы лаборатории должны быть направлены на получение идентификационных данных, а МГИ характеризуются сложностью и трудоемкостью, желательно, чтобы иммунологические методы отличались высокой технологичностью, простотой в исполнении и экспрессностью, что значительно снизит трудозатраты при определении групповой и видовой принадлежности.
В судебной серологии в нашей стране основными методами для установления групповой принадлежности являются реакция абсорбции-элюции (РАЭ), количественная реакция абсорбции (КРА), реакция «смешанной агглютинации» (РСА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ). В тоже время, такие методы, как иммуноферментный анализ (ИФА) и метод иммунохроматографии, ещё не нашли широкого распространения в практике СМЭВД.
Представляется крайне актуальным в соответствии с изменившимися требованиями к анализу объектов СМЭВД разработать соответствующую схему пробоподготовки биологических микрообъектов, модифицировать иммунологические методики и определить очерёдность их применения для получения максимально возможной информации.
Цель работы.
Разработка иммунологических методов исследования, пригодных для использования в системе комплексного анализа микроследов человека, с целью получения максимально возможного объема информации.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:
1. Подобрать МКА, пригодные для использования в РАЭ с целью установления групповой принадлежности таких объектов СМЭВД, как следы крови, слюны, микрофрагменты волос, частицы перхоти. Приготовить реагенты на основе доступных МКА.
2. Определить влияние различных факторов на специфичность и чувствительность иммунологических реакций. Разработать как общие, так и характерные для каждого вида биологических объектов способы повышения специфичности и чувствительности иммунологических реакций.
3. Разработать схему пробоподготовки и определить оптимальные условия проведения иммунологических реакций при исследовании каждого типа биологических микрообъектов.
4. Подобрать модификации иммунологических реакций для установления групповой и видовой принадлежности, позволяющие исследовать серийные образцы и проводить экспресс-анализ.
5. Разработать общие принципы комплексного анализа следов человека. Определить место иммунологических методик в системе комплексного анализа.
6. Провести экспертную апробацию разработанных методик и тактических подходов.
ВЫВОДЫ.
1. Разработанные высокочувствительные и специфичные модификации РАЭ позволяют выявлять антигены системы АВО в следах крови, в следах слюны (на поверхности клеток буккального эпителия и в надосадочной части), в микрофрагментах волос и в частицах перхоти. Условия проведения пробоподготовки и этапов реакции оптимизированы в соответствии с учётом морфологических и биохимических свойств различных микрообъектов и свойств МКА.
2. Подбор для каждого исследуемого объекта подходящих по свойствам МКА из линейки антител с различной эпитопной специфичностью, и, при необходимости, приготовление реагентов из асцитной жидкости путем проведения соответствующей очистки и концентрирования иммуноглобулинов, позволяет с успехом использовать МКА для выявления антигенов с помощью РАЭ.
3. Предложенные способы предотвращения неспецифических взаимодействий, общие (использование неионного детергента твин 20, предварительное прогревание биологического материала на водяной бане) и специфичные для каждого вида биологических объектов, позволяют повысить чувствительность методик при исследовании микрообъектов.
4. Строгое соблюдение разработанных правил проведения иммунологических реакций и хранения реагентов позволяет стандартизировать условия проведения реакций и получать стабильные результаты.
5. Разработанные методики РАЭ – гель-фильтрация, одностадийный вариант дот-ИФА пригодны для исследования серийных образцов.
6. Предложенное использование ПВДФ мембраны и разработка методики РИФ в дот-варианте позволяет проводить экспресс-анализ групповой и видовой принадлежности.
7. Внедрение в экспертную практику разработанных принципов комплексного подхода, выбор соответствующих методик и использование их по определённой схеме в соответствии с важностью получаемых данных, с учетом характера и состояния объектов, подлежащих исследованию, позволяет получить максимально возможную информацию при исследовании микроследов. Раздельное исследование составных элементов биологического материала следа (клеточного осадок и надосадочной жидкости) иммунологическими методами позволяет сэкономить биологический материал для МГИ, получать более достоверные данные при исследовании загрязненных объектов, а также предоставляет возможность более корректной оценки результатов реакции.

Подробнее