Диффлизис

Уважаемые участники форума, спасибо Вам огромное, всегда шустро отвечаете, научите стремящегося методике диффлизиса 2 фракций с применением Chеlex-100,
пожалуйста.

Дифлизис с Килексом? Плохая идея.

Уважаемый 'Pih'!
Запрашиваемая Вами методика стала в последнее время весьма популярна. Есть куча статей, протоколов и даже книг, где этот метод исследуется и внедряется. На практике, он уже давно применяется. Прикрепляю протоколы сего касающиеся.

Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Успехов.

Особенно понравилась методика выделения ДНКи из косточек с помощью Килекса-100 с 30-ти минутной инкубацией при 56 градусах Цельсия. Писал явно теоретик, а не практик! Полный бред!!!

[На практике с волосами из расчесок и следами с зубных щеток часто получалось? Спасибо опять, угощу красным сухим правильным винои при встрече.

Дифлизис с Килексом? Плохая идея.
Это безусловно, но шанс, полагаю, есть, иногда надо быстро, хотя быстро хорошо не бывает, но мы не верим в приметы, а когда биоматериала много - почему нет?

А если мало?

Уважаемый 'Pih'!
Идея может быть и плохая, но является запатентованной и давно реализована. Чтобы это не казалось пустыми словами прикрепляю статью, где проводят сравнение метода с килексом и другой новой разработки, коммерческого набора.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Успехов.

Уважаемый Зубр! Спасибо за статью. Статья конечно интересная, но больше все-таки в для теоретических рассуждений о пользе Килекса. Дамочки в статье пишут, что они симулировали половые преступления, т.е. напихали в пробирку спермы и женских эпителиальных клеток и начали выделять Килексом. И - Das ist Fantastisch! Все получилось просто зашибись. Я Вам скажу, что со свежей спермой и эпителиальными клетками и Direct PCR без всяких проблем пойдет. А вот если бы эти уважаемые исследовательницы взяли бы ткань (например, трусы) с пятнами спермы годовалой давности (а у меня был прециндент - пятнам спермы 9 годков стунуло) и навытаскивали бы оттуда ДНКи с помощью Килекса. Вот тогда - снял бы я шляпу и поклонился бы им в ноженьки. А так: НЕ ВЕРЮ!!!
Кстати, когда я читал статью, меня больше интересовал вопрос: Где они сперму то брали?
С уважением.

т.к. являюсь участником форму сравнительно недавно, то простите, но пишу в уже устаревшие темы. Хочется сказать, что у нас была экспертиза: сперма на трусах примерно 5-летней давности. Выделены объекты Килексом и получились чудесные четкие результаты!!

это не правило, не всегда получается, но Килексное выделение мы используем ОЧЕНЬ часто!!

Всем здравствуйте.
Не могу понять, при чём здесь "Челексом" или "не Челексом"???
Если я правильно понимаю, дифлизис необходим для того, чтобы отделить сперму от других ненужных клеток путём разрушения этих самых ненужных клеток. Так? И если после дифлизиса в пробе мы кроме спематозоидов ничего больше не наблюдаем (а для этого необходимо сделать препаратик), то выделяйте ДНК хоть валенком :-)).

Спасибо.

Поделитесь опытом пожалуйста, сколь лучше всего внести протеиназы К, чтобы дифлизис прошел успешно с первого раза (ну или со второго уж точно)? Объект - содержимое влагалища: много влагалищного эпителия с немногочисленными сперматозоидами. Очень хочется вытянуть чистую спермальную фракцию, чтобы не "вылазила" потерпевшая... Делала: 150 мкл лизирующего раствора (который из трис-HCl, NaCl, SDS, EDTA и воды) +16 мкл протеиназы К (20 мг/мл) на 50 мкл осадка. И как-то не до конца разделяется даже после второго раунда дифлизиса. Может что-то с протеиназой? или с головой?
Заранее спасибо!

Во-первых, абсолютно чистую спермальную фракцию получить не всегда возможно, да и не нужно (достаточно довести до >10% муж. ДНК в образце). Дело в том, что мужская ДНК при дифф. лизисе теряется и чем выше очистка, тем больше потери.
Во-вторых, у Вас что-то слишком много протеиназы, достаточно раза в 3 меньше (слишком много постороннего белка очистке тоже не способствует).
В-третьих, на такой объем осадка буфера надо бы раза в 2-3 больше брать (перегруз материалом -> хуже очистка).
Ну и наконец, если есть возможность, пользуйтесь промеговским Differex'ом. Он дает наилучший результат: http://www.investigativegenetics.com/content/2/1/11

Спасибо огромное! Дифферекс есть, но пока не пробовали... Надо будет с ним поэкспериментировать... Просто билась-билась с дифлизисом именно с этим объектом... все равно смесь не стала уже дальше доочищать дабы вообще сперматозоиды не потерять... придется смесь давать. Плюс Y-filer'ом поставила - чистенько получился. Вместе, думаю, достаточно будет...

Это нормально, см. статью по ссылке (доступ открытый). Там тоже в одном из образцов чистую мужскую ДНК выделить не удавалось в разных лабах и разными методами. Дело индивидуальное, зависит от образца, можете себя не винить