Изолирование циннаризина из крови

Коллеги! Требуется здравый взгляд на следующую ситуацию: в анализе на лекарственные нахожу циннаризин (в щелочных извлечениях: ТСХ-скрининг - заподозрен, ВЭЖХ/УФ и ГХ/МС - подтвержден). Для того, чтобы в качестве причины смерти 22-летнего парня (вместе с 0,8 промилле этанола) он выглядел убедительно, решил сделать количественное определение в крови. На всякий случай порылся в литературе предпоследних лет (в последние годы, каюсь, слежу - но запоминаю уже хуже). Нашел одну-единственную статью (Прокопенко В.М., Слободская В.В., Шапот Е.В. Изучение фармакокинетики циннаризина. - Фармация, 1991, № 2, с.72-73). Методика изолирования есть, но! "К 1 мл сыворотки... добавляли 0,25 мл 1 М раствора соляной кислоты и 5 мл хлористого метилена, встряхивали.., центрифугировали.., высушивали...". Далее - ВЭЖХ. Здесь я ступор и впал. Вроде ведь типичное вещество оснОвного характера - два третичных азота, с чего ему из кислой среды экстрагироваться? Может, слишком липофилен (судя по структуре)? А может, просто опечатка - и не стОит это все тяжких раздумий. На всякий случай сделал два изолирования из цельной крови: одно - из кислого, почти по статье - хлороформом (сухой остаток - как всегда, бурый, обильный), второе - тем же хлороформом, но после подщелачивания карбонатно-гидрокарбонатным буфером до рН 9-10 (сухой остаток - чуть желтоватый, поменьше). Залил их водным раствором перхлората лития-хлорной кислоты, завтра буду делать ВЭЖХ (количественное определение - по абсолютной площади пика, по барамовской базе данных, без учета выхода метода изолирования). Понимаю, что лучше бы было найти внутренний стандарт, построить график и учесть тем самым выход, "поиграться" с различными экстрагентами... Честно говорю - при нагрузке более 200% - пытаюсь обойтись разумным минимумом. До завтра есть немного времени. У кого есть что сказать по теме - буду очень признателен.

Здравствуйте. Сам оригинал методики я не читал, но скорее всего это ошибка. Циннаризин хорошо растворим в кислой среде и очень плохо в нейтральной и щелочной. Мы извлекаем его из щелочной среды (добавляем в к 1 мл крови 100 мкл конц. раствора амииака) эфиром, а затем реэкстракция в кислый раствор (0,5% раствор муравьиной кислоты), поскольку элюент у нас формиатный, и на ВЭЖХ С DAD. В.С. папаверин 1 мкг/мл. Аналитическая длина волны 250 нм. . Успехов!

Добрый вечер и спасибо, коллега А58. Версия про ошибку авторов и у меня была в качестве самой вероятной (хотя, поскольку там в качестве стардарта аналогичным образом исследовали сыворотку с известной концентрацией циннаризина и расчет проводили по пропорции - возможны были варианты типа кофеина - "в первую же хлороформную фазу"...). Скажите, думаю, вы щелочное извлечение сначала испаряете досуха, а затем уже сухой остаток обрабатываете дозированным небольшим объемом кислого раствора (ибо представить себе, что минимальный объем водного раствора не "провалится" в эфирную фазу - не могу), так? У вас по этому поводу не возникала мысль, что "вымыть" с жирной пленочки извлечения (пусть даже и совсем небольшой толщины) вещества оснОвного характера трудно - велики потери? Или при использовании внутреннего стандарта это не критично? Я что-то побоялся в данном случае растворять сухой остаток в нескольких каплях гексана - как делаю обычно - и делать ЖЖ-реэкстракцию - по причине высокой липофильности циннаризина. Ладно, дождусь до завтра - если концентрации будут "приличные" - оставим так; будут маловаты - придется "улучшать" методу...

Уважаемый коллега. Поскольку токсические концентрации циннаризина довольно велики, нас не смущают его потери при подготовке пробы. Щелочное извлечение мы не испаряем, а прямо в него довавляем 0,5 мл 0,5% раствора муравьиной кислоты и 0,3 мл нижнего водного слоя переносим в виалу автосамплера. Поскольку состав реэкстракта близок к составу элюента вводить в хроматограф можно до 50 мкл, что обеспечивает ПрО порядка 0,05 мкг/мл. Хотя методика пока не валидирована, так как применяется редко. Когда дойдут руки, попытаемся ее оттестировать.

Еще раз спасибо за информацию. Мы на Милихроме А-02 стараемся работать со стандартными объемами пробы - 4 мкл, очень редко - до 10 мкл. Лимитирует количество денюжек на новые колонки. Ваши соотношения объемов - 1 мл крови - 0,5 мл реэкстракта - впечатляют. Завтра отпишу о своих результатах.

Еще раз здравствуйте Коллега!
Мы работаем на Egilent 1200 и используем предколонку, хотя она тоже не дешевая. Однако колонка стоит у нас больше 2-х лет, а предколонки мы меняли раз 4-5 за это время. Вообще аппарат оснащен МС детектором, однако в настоящее время он не работает из-за проблем с генератором азота, поэтому у нас все элюенты летучие ( ацетаты и формиаты), которые не оптимальны для УФ детектора. Поэтому при оптимизации методики у Вас может получиться лучше. чем у нас.

Доброго времени суток, коллеги!
Докладываю, что получилось. В целом - "не догнал..., но согрелся". Авторы статьи, заподозренные в ошибке - реабилитированы. Итак, две пробы крови (по 2 мл), обе, после разбавления водой (1:1) экстрагированы хлороформом, двухкратно (3+3 мл); одна - при рН 1-2, вторая - при рН 9-10. Извлечения высушены в токе теплого воздуха, сухой остаток обработан в течение 21 часа 200 мкл раствора перхлората лития и хлорной кислоты (ЗАО "ЭкоНОВА"), по 4 мкл - на ВЭЖХ/УФ. Режим - опускаю. В объектах, помимо циннаризина - неплохой кофеин. Их площади на хроматограммах (только числовые значения): из кислого извлечения - 0,500 и 12,539; из щелочного извлечения - 0,500 и 12,137, соответственно. Убоявшись, что из жирноватого сухого остатка не все вымылось, еще раз извлек 2 мл крови при рН 9-10, извлечение упарил досуха, сухой остаток растворил в 4 каплях гексана и реэкстрагировал теми же 200 мкл кислого водного раствора. Площади пиков циннаризина и кофеина - 0,661 и 11,613. Это соответствует их концентрации в крови 0,16 и 2,5 мкг/мл (но без учета выхода метода изолирования). Маловато будет - попадает в терапевтичнский уровень... хотя есть же еще этанол. Похоже, придется или все же делать затравку, чтобы определиться с потерями при изолировании, или интересоваться у танатолога - может, ее устроит...