Определение возраста по образцам слюны с применением ДНК-анализа



Форум судебных медиков России > Судебная медицина и судебно-медицинская экспертиза > Судебно-медицинская генетика
Odessit
Уважаемые коллеги, здравствуйте!
Помогите пожалуйста в вопросе об установлении возраста человека по образцам слюны с применением ДНК-анализа, в принципе о возможности проведения такого анализа для криминалистических целей в судебно-медицинской молекулярно-генетической лаборатории. Интересует практически все!!!
Заранее благодарен за помощь!!


Gordiz
Цитата(Odessit @ 6.07.2011 - 14:20)
Уважаемые коллеги, здравствуйте!
Помогите пожалуйста в вопросе об установлении возраста человека по образцам слюны с применением ДНК-анализа, в принципе о возможности проведения такого анализа для криминалистических целей в судебно-медицинской молекулярно-генетической лаборатории. Интересует практически все!!!
Заранее благодарен за помощь!!

Уважаемый Odessit!
В настоящее время нет надежных методов определения возраста человека по ДНК. Есть методы, дающие очень большой разброс: подсчет хромосомных аббераций в лимфоцитах, оценка гетероплазмии мтДНК или длины теломерных участков хромосом. Наиболее точный метод основан на количественном анализе перестроек гена TCR в Т-лимфоцитах и отражает активность тимуса, которая в свою очередь связана с возрастом. Метод описан в прикрепленной статье, дает разброс +/- 9 лет при условии, что человек здоров. Но все эти методы неприменимы к образцам слюны.


Odessit
Цитата(Gordiz @ 7.07.2011 - 00:38)
Уважаемый Odessit!
В настоящее время нет надежных методов определения возраста человека по ДНК. Есть методы, дающие очень большой разброс: подсчет хромосомных аббераций в лимфоцитах, оценка гетероплазмии мтДНК или длины теломерных участков хромосом. Наиболее точный метод основан на количественном анализе перестроек гена TCR в Т-лимфоцитах и отражает активность тимуса, которая в свою очередь связана с возрастом. Метод описан в прикрепленной статье, дает разброс +/- 9 лет при условии, что человек здоров. Но все эти методы неприменимы к образцам слюны.



Здравствуйте уважаемый Gordiz! Спасибо за ответ! Однако, у нас некоторые спецы считают, что внедрение свежих открытий в практику является приоритетной задачей для судебных генетиков. А именно, интернет завален - "открытиями, определения возраста по слюне (буккальный эпителий), основанными на изучении процессов метилирования ДНК и обнаружения надежных маркеров старения, Калифорния". Можно узнать Ваше мнение на этот счет. Спасибо!


Gordiz
Цитата(Odessit @ 7.07.2011 - 11:09)
А именно, интернет завален - "открытиями, определения возраста по слюне (буккальный эпителий), основанными на изучении процессов метилирования ДНК и обнаружения надежных маркеров старения, Калифорния". Можно узнать Ваше мнение на этот счет. Спасибо!

Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.


Odessit
Цитата(Gordiz @ 8.07.2011 - 00:02)
Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.




Вечер добрый, уважаемый Gordiz и коллеги! Спасибо за Ваше мнение!
Если я правильно Вас понял, если нет, исправьте пожалуйста! Вы считаете, что есть возможность проведения фрагментного анализа (микросателлитные локусы) с целью определения поставленной задачи?! Это в принципе очень важно и актуально при расследовании половых преступлений! Как вы думаете, можно применить данный фрагментный анализ при работе со биоследами (любыми)?
Спасибо за помощь!!!!




Gordiz
Цитата(Odessit @ 20.07.2011 - 21:21)
Вечер добрый, уважаемый Gordiz и коллеги! Спасибо за Ваше мнение!
Если я правильно Вас понял, если нет, исправьте пожалуйста! Вы считаете, что есть возможность проведения фрагментного анализа (микросателлитные локусы) с целью определения поставленной задачи?! Это в принципе очень важно и актуально при расследовании половых преступлений! Как вы думаете, можно применить данный фрагментный анализ при работе со биоследами (любыми)?
Спасибо за помощь!!!!

Уважаемый Odessit!
Если создавать систему для практического использования опубликованных данных, необходимо наладить одновременный анализ шести мишеней: метилированное и неметилированное состояние для каждого из трех наиболее информативных маркеров, описанных в статье. Желательно, чтобы соблюдался принцип: один образец - одна пробирка (т.е. мультиплекс) и использовался метод колличественной детекции, уже имеющийся в действующих судебно-генетических лабораториях. Таких методов два: Real-Time PCR и фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Предпочтительным методом является Real-Time PCR, поскольку он дает более точную колличественную оценку. Но, к сожалению, у нас судебно-генетические лаборатории комплектуются морально устаревшими приборами ABI 7000/7500, малопригодными для проведения мультиплексыных реакций.
Остается фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Описаны разные возможности использования этого метода для количественной оценки степени метилирования: аллель-специфичная ПЦР после бисульфитной конверсии, однонуклеотидная достройка праймеров, метилчувствительные рестриктазы. Но в любом случае это будет совершенно новая система, никак не связанная с анализом тандемных повторов.
И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.


Зубр
Доброго времени суток, коллеги!
Цитата
И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.

И вместе с тем, чтобы этот метод возымел практическое значение не достаточно валидации в какой-то одной лаборатории. Это должна быть масштабная работа нескольких центров судгенетики с серией публикаций в ведущих журналах, причём эта работа заранее не обречена на успех, так как не всё может оказаться адекватно задуманному, могут возникнуть сложности и прочие моменты неопределённости. Посему, уповать на быстрое и надёжное внедрение в практику только что совершённого изобретения - я бы не стал.
Всем привет.


genosys
Цитата(Gordiz @ 8.07.2011 - 00:02)
Уважаемый Odessit!
Я действительно отстал от жизни. А Вы напротив, работаете на самом острие науки! С момента выхода статьи прошло всего две недели, а Вы уже вовсю внедряете новый метод. Забавно, что изначально в опубликованном исследовании планировалось обнаружить зависимость между метилированием и сексуальной ориентацией, но не получилось. А полученным данным нашли другое применение. Авторы заявляют точность определения возраста по степени метилирования 80 маркеров – 5,2 года. Правда, выборка у них невелика. Конечно, в экспертной лаборатории нереально тестировать все 80 маркеров, но авторы предложили три наиболее информативных локуса для упрощенного варианта анализа. В статье для этого использовали масспектрометр и пиросеквенатор. Но, думаю, эти маркеры можно тестировать и с помощью RealTime PCR или фрагментного анализа. Лишь бы это было кому-то нужно.

Господа, товарищи и бояре, читайте статьи в Плос1 исключительно критически! Заявленная точность метода в 5.2 года - это на самом деле среднее по разнице между реальным и наблюдаемым возрастом (residuals), что является, мягко говоря, нестандартной оценкой точности. Если тот же самый "метод" использовать для оценки точности sjTREC метода, то он окажется раза в 2 лучше, чем установление возраст по метилированию ДНК в слюне. Соот-но, если рассчитать нормально, как общепринято, Стандартную Ошибку Оценки (SEE) для слюны, то она составит порядка +/- 15 лет.
Тем не менее, метилирование ДНК - действительно мощный предиктор хронологического возраста. Жаль только, что некоторые пидорасы недобросовестные ученые умудряются тискать паршивые статейки в паршивых журанальчиках поперед ответственных ученых mad.gif

Цитата(Зубр @ 22.07.2011 - 22:39)
Доброго времени суток, коллеги!

И вместе с тем, чтобы этот метод возымел практическое значение не достаточно валидации в какой-то одной лаборатории. Это должна быть масштабная работа нескольких центров судгенетики с серией публикаций в ведущих журналах, причём эта работа заранее не обречена на успех, так как не всё может оказаться адекватно задуманному, могут возникнуть сложности и прочие моменты неопределённости. Посему, уповать на быстрое и надёжное внедрение в практику только что совершённого изобретения - я бы не стал.
Всем привет.

Совершенно верно! Эта "масштабная работа без шансов на успех" wink.gif называется Developmental Validation - практически стандарт для новых ДНК-методов.

Цитата(Gordiz @ 21.07.2011 - 08:48)
Уважаемый Odessit!
Если создавать систему для практического использования опубликованных данных, необходимо наладить одновременный анализ шести мишеней: метилированное и неметилированное состояние для каждого из трех наиболее информативных маркеров, описанных в статье. Желательно, чтобы соблюдался принцип: один образец - одна пробирка (т.е. мультиплекс) и использовался метод колличественной детекции, уже имеющийся в действующих судебно-генетических лабораториях. Таких методов два: Real-Time PCR и фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Предпочтительным методом является Real-Time PCR, поскольку он дает более точную колличественную оценку. Но, к сожалению, у нас судебно-генетические лаборатории комплектуются морально устаревшими приборами ABI 7000/7500, малопригодными для проведения мультиплексыных реакций.
Остается фрагментный анализ на генетическом анализаторе. Описаны разные возможности использования этого метода для количественной оценки степени метилирования: аллель-специфичная ПЦР после бисульфитной конверсии, однонуклеотидная достройка праймеров, метилчувствительные рестриктазы. Но в любом случае это будет совершенно новая система, никак не связанная с анализом тандемных повторов.
И, конечно, до внедрения ее нужно валидировать на большом количестве разных образцов.

Реально, методов конечно больше, чем два, причем "морально устаревшие" ABI вполне для этих методов пригодны (собс-но они неплохо годятся и для мултиплексной ПЦР, кабы этот мультиплекс вообще был нужен...). Например, с использованием рестирктаз, чувствительных к метилированию. А вот бисульфитная конверсия для криминалистических образцов как раз мало подходит, уж больно кол-ва исходной ДНК требуются (не верьте рекламам про суб-нанограмную чувствительноть бисульфитных китов, реально нужны сотни нг для надежной работы!).


Gordiz


genosys


Gordiz
Цитата(genosys @ 3.08.2011 - 03:01)

Другое дело, что разработать хороший даже даблплекс уже реально непростая задача, если делать все грамотно для точной количественной оценки. Триплекс и выше - уже можно практически забыть, что удасться оптимизировать олиги так что они не будут взаимно влиять на эффективность ПЦР каждой отдельной реакции.

Когда-то создание STR-триплекса считалось непростой задачей. Сейчас все пользуются STR-мультиплексами с десятками олигов в одной пробирке, и олиги особо не мешают друг другу работать колличественно. Подтверждением тому является применение мультиплексных систем для колличественного анализа химеризма после пересадки костного мозга. Почему же олиги вдруг начнут мешать друг другу попав в прибор для RealTime? Что реально мешает, так это слабая аппаратная и программная реализация мультиканальной детекции. По этой причине для "многоканального" ABI 7000 одновременный анализ более двух мишеней противопоказан , а это самый массовый прибор в экспертных лабораториях России.

Цитата
Но я что-то не знаю ни одного форензик qPCR теста с триплексом...

Чем Quantifiler DUO не триплекс? Внутренний контроль - тоже колличественная мишень.

Цитата
В Голландии например с законодательством в этом смысле все в порядке.

Голландия вообще во многих смыслах раскрепощенная страна smile.gif . Но в целом наблюдается тенденденция к усилению защиты прав граждан. А раскрытие информации о фенотипе в ходе генетической экспертизы считается грубым нарушением этих прав, поэтому разработки в области предсказания внешних признаков скорее всего массового применения не найдут. К сожалению.


genosys
Цитата(Gordiz @ 4.08.2011 - 00:52)
Когда-то создание STR-триплекса считалось непростой задачей. Сейчас все пользуются STR-мультиплексами с десятками олигов в одной пробирке, и олиги особо не мешают друг другу работать колличественно. Подтверждением тому является применение мультиплексных систем для колличественного анализа химеризма после пересадки костного мозга. Почему же олиги вдруг начнут мешать друг другу попав в прибор для RealTime? Что реально мешает, так это слабая аппаратная и программная реализация мультиканальной детекции. По этой причине для "многоканального" ABI 7000 одновременный анализ более двух мишеней противопоказан , а это самый массовый прибор в экспертных лабораториях России.

Меня всегда напрягает, когда по фореграммам мултиплекса с десятками мишеней начинают какие-то количественные выводы делать. Видимо все-таки школы разные и представления о точности соот-но, мне после мРНК маркеров это ересью кажется smile.gif
Олиги имеют св-во отжигаться друг на друге, образовывать димеры и пр., любой мультиплекс стараются оптимизировать на этапе дизайна праймеров с помощью соответственных программ (которые впрочем помогают далеко не всегда). Чем больше олигов в кучу намешать, тем меньше шансов на успех. Т.е добиться амплификации десятка мишеней не так и сложно, сложно устранить предпочтительную амплификацию одних мишеней в ущерб остальным, тут еще и размер ампликона влияет. Перекрытие каналов тоже имеет место, но тот же Quantifiler DUO на 7300 работает, т.е. NED, VIC и FAM (+ROX) друг другу не особо мешают, насчет 7000 не в курсе.


Цитата(Gordiz @ 4.08.2011 - 00:52)
Чем Quantifiler DUO не триплекс? Внутренний контроль - тоже колличественная мишень.

да, Вы правы, про IPC я и забыл smile.gif Ну, все-таки согласитесь, мултиплексная qPCR вещь достаточно непростая для разработки.

Цитата(Gordiz @ 4.08.2011 - 00:52)

Голландия вообще во многих смыслах раскрепощенная страна smile.gif . Но в целом наблюдается тенденденция к усилению защиты прав граждан. А раскрытие информации о фенотипе в ходе генетической экспертизы считается грубым нарушением этих прав, поэтому разработки в области предсказания внешних признаков скорее всего массового применения не найдут. К сожалению.

О, на эту тему можно так развернуться! Например, нарушает ли ДНК-реконструкция внешности гражданские права трупа? И не является ли усилением прав живых граждан предоставление полиции доп. инструмента в расследованиях? Реально же я считают, что будет как у Хайнлайна: будет скафандр - будет и путешествие wink.gif


Gordiz


genosys
Цитата(Gordiz @ 12.08.2011 - 02:01)
Напрасно напрягаетесь. На искусственных смесях ошибка составляет несколько процентов.
Но опыт создания больших мультиплексов для капиллярников как раз демонстрирует возможность равномерной амплификации множества мишеней в достаточно широком диапазоне концентраций. При этом может снижаться эффективность ПЦР, но как известно, это не является препятствием для колличественной оценки.

вот-вот, именно такая уверенность, неизвестно на чем основанная, меня и напрягает rotate.gif
Какие "несколько процентов"?! Разница в эффективности ПЦР в 5% через 30 циклов вызывает более чем двухкратную разницу в амплификации мишени (2^30 vs 1.95^30). Но 5% - это цветочки! Некие "гении" попытались мои два синглплекса тупо в дуплекс превратить, так у них эффективность мультиплекса составила 60% (это с почти 100% исходных), самое интересно, что они мне еще и претензии высказали, тоже были уверены в "равномерной амплификации множества мишеней" biggrin.gif


Gordiz
Цитата(genosys @ 12.08.2011 - 13:26)
вот-вот, именно такая уверенность, неизвестно на чем основанная, меня и напрягает rotate.gif
Какие "несколько процентов"?! Разница в эффективности ПЦР в 5% через 30 циклов вызывает более чем двухкратную разницу в амплификации мишени (2^30 vs 1.95^30).

Уверенность основана на опыте прогрессивной части человечества smile.gif В случае колличественной ПЦР как правило параллельно с образцами ставятся колличественные стандарты. При этом точность колличественной оценки не зависит от эффективности ПЦР при условии, что в стандартах и образцах эффективность ПЦР одинаковая. Эффективность важна скорее для чувствительности системы. При эффективности 60% может просто не хватить циклов, чтобы что-то увидеть.


genosys
Цитата(Gordiz @ 17.08.2011 - 07:37)
Уверенность основана на опыте прогрессивной части человечества smile.gif В случае колличественной ПЦР как правило параллельно с образцами ставятся колличественные стандарты. При этом точность колличественной оценки не зависит от эффективности ПЦР при условии, что в стандартах и образцах эффективность ПЦР одинаковая. Эффективность важна скорее для чувствительности системы. При эффективности 60% может просто не хватить циклов, чтобы что-то увидеть.

Прогрессивное человечество только-только дозрело до выработки хоть каких-то лабораторных стандартов для количественной ПЦР (MIQE), не прошло и 20 лет с момента разработки метода. И многие (а среди форензик сайнтистс - большинство rolleyes.gif ) до сих пор плевать на эти стандарты хотели. Так что, если этот опыт со здравым смыслом не пересекается, зачем на него ссылаться?

Внешняя калибровка с одной стороны действительно могла бы помочь устранить эффект неравномерной эффективности ПЦР в определенном диапазоне концентраций, с другой - она реально может создать больше проблем, чем способна решить, потому ее использование не отменяет оптимизации мультиплекса по эффективности. Стандарты всегда разводят из хорошей ДНК, которой практически никогда не бывает в реальных образцах, особенно, криминологических. Примеси и деградация ДНК (в случае кДНК, еще и артефакты обратной транскрипции) легко способны исказить количественную оценку во многие разы. Если еще и эффективность не оптимальна, можно смело посылать описание мультиплекса в прогрессивный журнал, типа FSI: Genetics на горе тем, кто попытается его в реальной жизни применить biggrin.gif


Gordiz
В продолжение обсуждения прикрепляю постер от авторов выложенной ранее статьи про определение возраста на основе уровня ДНК-маркера sjTREC.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
В данной работе предлагается комбинированный метод, учитывающий уровень экспрессии и метилирования множества генов. Будем ждать от авторов полноразмерной статьи.
И пусть не говорят, что российские судебные генетики не занимаются наукой. Занимаются! Только не в России...


Русская версия Invision Power Board © 2001-2017 Invision Power Services, Inc.

© 2002-2015 Форум судебных медиков
При копировании материалов сайта размещение активной ссылки на источник обязательно!