Лэддер эффект

Здравствуйте уважавемые коллеги!
Впервые столкнулся с таким явлением.
В результате проведённого электрофореза при исследовании ДНК выделенной из костной ткани на элетрофорграмме получился "частокол" пиков очень похожий на леддер. Причём подавляющее количество пиков попало в бины. Высота пиков в пределахлокусов миеняется волнообразно.
При исследовании использовал мультилокусный набор Айдентифайлер и Минифайлер.
Мне сказали это так называемый леддер эффект который проявляется при ПЦР деградированной ДНК.
Кто-нибудь сталкивался с таким явлением? И вообще возможно ли в этом случае получить нормальный профиль?
У меня такая ситуация, что из четырёх костей (останки разных людей) в трёх получилось то о чём я написал.

Выделял ДЖНК ПрепФайлером с БТА буфером.

Уважаемый 'rostandrei'!

Разрешите несколько уточняющих вопросов.
1. Какова концентрация ДНК по Quantifiler?
2. Все системы дают "леддер-эффект" или часть?
3. Какое состояние костей?
Но даже без ответа на эти вопросы, можно сказать, что, скорее всего, придётся перевыделять ДНК из трёх костей. Что-то с выделением, проанализируйте все этапы.
Успехов.

1. Концентрация ДНК 0,010; 0,012 0,018 нг/мкл
2. Все системы, в разной степени, дают указанный эффект.
3. Чисто внешне кости не кажутся "убитыми". Достаточно плотные, внутри костный мозг (в виде вонючего жировоска).

Может это от набора для выделения зависит? При использовании фенольного метода, такого не было.

Спасибо

Попытаюсь картинки прикрепить.

Нажмите для просмотра прикрепленного файла

[/quote]Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Здравствуйте уважавемый коллега
извините, но я еще не сталкивался типо таких случаях, так что извините коллега

Уважаемый коллега 'rostandrei'!

Низковата концентрация, конечно (полагаю, что объём пробы = 50мкл). Если Вы в полный объём ПЦР вносите 10 мкл, то всего 100pg на реакцию. Это бы ещё ничего, но, скорее всего, ДНК в пробах изрядно деградирована. Это подтверждает и Ваш второй пункт.



Полагаю, что дело в выделении. Где-то в протоколе надо искать слабое звено. Попробуйте на одной из костей выделить фенолом, станет многое ясно.
Успехов.

Уважаемый rostandrei!
Очевидно проблема в контаминации аллельным лэддером. Это особенно хорошо видно на первом рисунке. На хороших образцах контаминация может быть незаметной, поскольку вносимое количество ДНК успешно конкурирует с загрязнением (пока!). А в случае с костями, образца явно не хватает и преимущественно амплифицируется привнесенный лэддер. Скорее всего, количество вносимой ДНК образца еще меньше, чем Вы предполагаете. Для деградированной ДНК из костей результаты Quantifiler неинформативны, поскольку величина мишени у этого набора - 65 bp, что совершенно не актуально при анализе STR.
Среди людей, которые не верят в контаминацию, бытует суеверие, что данный “эффект лэддера” – это свойство деградированных образцов ДНК. Это удобная точка зрения, но она не объясняет, почему картинка по составу аллелей совпадает с коммерческим лэддером из набора.
Если повторять экстракцию ДНК, лучше сменить все реактивы, поскольку контаминация может быть на любом этапе: может быть загрязнен сам вещдок, набор для выделения , набор для амплификации, или все сразу.
Но проще поставить амплификацию с альтернативным набором. Другие праймеры в большинстве локусов не будут амплифицировать лэддер. Еще надежнее взять набор с локусами, отсутствующими в Identifiler и Minifiler.

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

Ваши рассуждения логичны. Логичны во всём, кроме одного: все слабые пробы должны быть контаминированы леддером. Коллега rostandrei обратил бы на это внимание, но проблема возникла именно с этими 3-мя костями. Предположим, что это "серия", то-есть загрязнение попало именно в этот раунд. Тогда и отрицательный контроль должен выглядеть аналогичным образом. Кстати, на фореграммах по ряду систем не все аллели леддера представлены, много пустот, один пик больше - другой меньше и нет плавности (синусоиды).

Да, конечно, для проверки гипотезы, а может и для получения таки результата генотипирования, этот вариант подходит. С другой стороны, в Identifiler и Minifiler разные праймеры, а контаминация есть в том и другом случае.
Всем привет.

Уважаемый Зубр,
Коллега rostandrei не утверждал и обратного, поэтому мы не знаем как выглядят другие слабые образцы и отрицательный контроль. Но предполагаю, что если провести отрицательный контроль начиная с этапа выделения ДНК, в нем аллельная лестница проявит себя со всей подобающей плавностью и без пробелов, поскольку будет отсутствовать конкурирующая матрица.

Скорее всего праймеры Minifiler способны амплифицировать лэддер Identifiler.

Уважаемые коллеги!
Огромное спасибо за представленные ответы и дискусию.
Для объективности внесу некоторые подробности. В серии РеалТайм-ПЦР-Форез присутствовало объектов на 5 ранов (17 шт.) это три кости, 13 образцов и 1 - спермальная фракция после дифф. лизиса с тампона с содержимым прямой кишки. Из исследованных проб кроме костей "слабым" по концентрации была проба спермальной фракции - 0,006 нг/мкл (при IPC 27). Понятно что представленную цифру принято принимать как отсутствие ДНК. Кроме того объект был представлен после биологии где спематозиодов не нашли,а дали наличие спермальной жидкости (т.к. PSA был+). Однако, попытавшись выжать из неё хоть что-то, я её сконцентрировал и поставил на ПЦР. В результате, конечно, ноль, но и лишнего ничего не вылезло.
Отрицательный контроль так же никакой контаминации не показал.
Думаю что на этапах РеалТайм-ПЦР-Форез контаминации не было.

Кроме того, одну из трёх костей перевыделял тем же Препфайлером параллельно с четвёртой костью (из Норильска). В результате перевыделенная дает леддер эффект, норильская проходит идеально - ну прямо как образец.

Думаю что всётаки дело в деградации. Представленные три кости с 2002 года лежали в земле под дачным домиком.

Уважаемый rostandrei!
Хорошо, что реактивы у Вас чистые. Но все же контаминация мне кажется единственным рациональным объяснением. Может быть человек, который пилил кости перед этим раскапывал форезную плашку или еще что-нибудь в этом роде. Как я понимаю, в Норильской кости концентрация ДНК выше?

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

И в той , и в другой предложенной версии есть несостыковки. Возможно, ответ где-то посередине. Т.е., есть и деградация, но есть и контаминация. Причём, мне кажется, что это контаминация не аллельным леддером, а суммой разных генотипов сотрудников лаборатории (а может и не только сотрудников). На сверхмалых количествах полагаю это возможно. Как Вам такая версия?
По поводу аллельного леддера и контаминации, прикрепляю полезную статью.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Всем привет.

Да, в Норильской кости концентрация ДНК 0,803 нг/мкл.

Мне подсказали, что этот эффект изучался Ивановым П.Л. В журнале "Судебно-медицинская экспертиза" за 2000 год сент-окт.; 43(5): 32-7 есть статья на эту тему.
Но я что-то не смог её найти...

С уважением, rostandrei.

есть вероятность, что "гребенка" появляется при изменении (уменьшении, модификации) специфичности полимеразы при взаимодействии с каким-то фактором (вероятно белковым). Тогда она будет амплифицировать несовершенные дуплексы, особенно при сильно разбавленной матрице. Кроме того, можно обсудить эффект ДНК-связывающих белков, которые могут "обманывать" полимеразу, конструируя якобы подходящий субстрат. То, что этот фактор белок, подтверждается улучшением ситуации после обработки фенолом.

всем привет, кое-кому поклон

Здравствуйте уважаемые!
Действительно, после фенольного выделения такого эффекта не наблюдал ниразу. Может у кого есть другой опыт?

Есть ещё мнение (у зарубежных коллег) что это контаминация, но не извне, а "контаминация своей (из кости) деградированной ДНК".

С уважением, rostandrei

Уважаемый Зубр!
Я бы все-таки настаивал на версии контаминации лэддером. Безусловно, возможна также контаминация другими ПЦР-продуктами, геномной ДНК, суммой генотипов сотрудников, но лэддер в любом случае явно присутствует. Например, на первой картинке, где эффект наиболее ярко выражен, в локусе FGA присутствуют аллели 42.2-51.2. Кроме как из лэддера им взяться больше неоткуда, если, конечно, в лаборатории не работает пара сотен африканских студентов. При этом как в коммерческом лэддере Identifiler, так и в "лэддер-эффекте" отсутствует аллель 49.2, хотя в природе он встречается. То же самое можно увидеть в других локусах.
Боюсь, что предположение о неком белковом агенте, вызывающем нематричную амплификацию аллельной лестницы также не может объяснить этот факт. Хотя было бы здорово, если бы такой белок существовал. Как просто было бы создавать лэддеры!

Доброго времени суток, коллеги!
А не пробовал ли кто-то из Вас раститровать аллельный леддер, проамплифицировать и разогнать?
Всем привет.

Уважаемый Зубр!
Нам приходилось реамплифицировать лэддер для возобновления его запаса, когда он заканчивался раньше остальных реагентов набора. Реамплифицированный лэддер выглядит похуже, чем оригинальный, но тоже работает. Нужно только быть внимательным: увеличенный статтер первого аллеля программа может воспринять как первый пик локуса и нумерация аллелей может сместится. В прикрепленном файле протокол.

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

Спасибо. Жаль только, что сначала кончаются праймеры, потом буфер, а уж потом - леддер .
Удачи.

Уважаемый Зубр! Бывают наборы, в которых сначала кончается лэддер. Например, раньше в наборах Qiagen лэддера хватало на 10 нанесений.
Всех с Новым Годом!

Добрый день ув. форумчане! Новый год прошел и тема затухла, я считаю необходимо её возобновить, т.к. в проблеме до конца так и не разобрались!
В моем, хоть и скромном, опыте уже не раз встречался подобный эффект, и всегда это был сложный объект (старая кость, очень гнилая кровь или ткань, грязные старые вещ.доки). Утверждать что это контаминация или белковое загрязнение утверждать не стану, т.к. имею мало практики по сравнению с большинством из Вас, но точно скажу что и при выделении фенолом, и при выделении сорбентом, наблюдал леддер эффект, при чем почти всегда он наблюдался не во всех локусах, а только в некоторых, в остальных типичная картина деградации ДНК.
Так что давайте думать и высказываться, может придем к единому предположению.

Коллеги, недавно выделяла ДНК фенолом из гнилостно измененных кусочков печени и сердца (брала 2 кусочка). Труп нашли в сточных водах. Ставила вертикальный форез, естественно ни один раз с перевыделением. Результат: в большинстве локусов пусто, в некоторых - по 4 четко выявляемых аллеля, совпадающих у органов в каждом локусе. Никто из сотрудников лаборатории не является обладателем подобных аллелей. Что это может быть? Деградация?

Уважаемая 'Lady'!

Вряд ли кто-то возьмётся отвечать, не видя картинок. Выложите фото пластин, тогда можно о чём-то порассуждать. Хорошо бы и методики выделения и очистки в более подробном режиме узнать - это помогло бы разбираться.
Удачи.

Здравствуйте уважаемые форумчане. Ситуация с нашим лэддер эффектом прояснилась (извините что отвечаю после большого перерыва). Поставили на ПЦР пустую пробу - с одним только BTA буфером, который использовался для выделения ДНК из костей. И он то и дал этот самый эффект! При более внимательном осмотре флакона, в котором он был получен, обнаружилась что крышка, как туго её не завинчивай, не обеспечивала герметичность. И тут я вспомнил что при вскрытии пакетика в котором содержался флакон, внутренности были влажными. Я посчитал это настолько невероятным, что решил что мне показалось... Оказалось что нет.

Да, это, безусловно, самый надежный на сегодняшний СМЭ день способ изготовления лэддераа

По-идее, "пустая" изоляция ДНК с последующим ПЦРом и форезом в параллеле с испытуемым образцом должна всегда проводиться в кач-ве контроля контаминации. Если средства не позволяют делать это каждый раз, то хотя бы раз в неделю или с каждой новой партией реактивов - обязательно! Как бы азы...