Выделение ДНК из кости



Форум судебных медиков России > Судебная медицина и судебно-медицинская экспертиза > Судебно-медицинская генетика
Affe04
Уважаемые коллеги. При выделении ДНК из б/берцовых и бедренной костей фен.- хлороф. методом. После осаждения этанолом, в 2-х пробах получил необычный осадок в виде прозрачной бесцветной желеобразной массы в количестве около 30 мкл ( кость после варки в МКО) . Во второй пробе - тоже самое, только светло-коричневого цвета. Кость после эксгумации. В земле - не более 5 лет. Такое впервые за много лет. Параллельно выделял кость после эксгумации от другого трупа с тем же сроком нахождения в земле и зуб от 4-го трупа - всё нормально. Во всех случаях, кроме зуба - 72 часа декальцинация. Лизис -около 18 часов с повторным добавлением протеиназы.
"Жидкий" осадок растворяется в воде. Опять залил спиртом и солью - осадок резко помутнел, впечатление, будто там громадное количество ДНК. Оставил на ночь. Помогите разобраться.


Зубр
Цитата(Affe04 @ 15.03.2012 - 18:55)
Уважаемые коллеги. При выделении ДНК из б/берцовых и бедренной костей фен.- хлороф. методом. После осаждения этанолом, в 2-х пробах получил необычный осадок в виде прозрачной бесцветной желеобразной массы в количестве около 30 мкл ( кость после варки в МКО) . Во второй пробе - тоже самое, только светло-коричневого цвета. Кость после эксгумации. В земле - не более 5 лет. Такое впервые за много лет. Параллельно выделял кость после эксгумации от другого трупа с тем же сроком нахождения в земле и зуб от 4-го трупа - всё нормально. Во всех случаях, кроме зуба - 72 часа декальцинация. Лизис -около 18 часов с повторным добавлением протеиназы.
"Жидкий" осадок растворяется в воде. Опять залил спиртом и солью - осадок резко помутнел, впечатление, будто там громадное количество ДНК. Оставил на ночь. Помогите разобраться.

Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.


Affe04
Цитата(Зубр @ 16.03.2012 - 00:07)
Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.


Здравствуйте уважаемый Зубр. После нового переосаждения и ф-х экстракции ни чего не изменилось. Вы правы, осадок ДНК так ни когда не выглядит. Даже из костей. Попробую эти пробы выделить набором АВ на магнитах. И по новой с ф-х. Время терпит. Пробовать генотипирование бесполезно. Осадок ДНК таким не бывает.


Lady
Цитата(Зубр @ 15.03.2012 - 23:07)
Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом.

Почему? В чем его преимущество?


Affe04
Цитата(Lady @ 16.03.2012 - 20:35)
Почему? В чем его преимущество?


Важно не этанол, пропанол, метанол... а почему ДНК не села нормальным осадком. Выделял набором АТГ, как обычно. В чём химизм события?


Зубр
Цитата(Lady @ 16.03.2012 - 20:35)
Почему? В чем его преимущество?

Есть отличия. позволяющие при решении разных задач, применять тот или другой спирт, те или другие соли, но есть и преимущества именно изопропанола. Посмотрите старую статью на сей счёт.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла


Affe04
Цитата(Зубр @ 18.03.2012 - 00:44)
Есть отличия. позволяющие при решении разных задач, применять тот или другой спирт, те или другие соли, но есть и преимущества именно изопропанола. Посмотрите старую статью на сей счёт.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла


Спасибо за статью. Убедительно. Получил генотипы там, где нормальный осадок. Завтра начну перевыделять Препфайлером. Там изопропанол. Спасибо за консультацию.


Пыхтачок
Цитата(Affe04 @ 20.03.2012 - 19:25)
Спасибо за статью. Убедительно. Получил генотипы там, где нормальный осадок. Завтра начну перевыделять Препфайлером. Там изопропанол. Спасибо за консультацию.



Набор реактивов PrepFilerTM Express Forensic DNA Extraction Kit (производства фирмы «Applied Biosystems», США) и система для экстракции ДНК Auto Mate ExpressTM Forensic DNA Extraction System в соответствии с прилагаемой к набору инструкцией. И никаких проблем smile.gif


prostochock
Цитата(Зубр @ 16.03.2012 - 00:07)
Если это ДНК, то не ДНК человека. Скорее всего всё же это не ДНК. Проверьте концентрацию и качество - REAL-time PCR, электрофорез, генотипирование, в конце концов. Переосаждать лучше изопропиловым спиртом, а не этанолом. Кстати, при получении ДНК из костей всегда есть некий осадок, явно более значительный, чем возможное количество ДНК. Этот осадок не мешает дальнейшему генотипированию.
Удачи.
[font=Times New Roman][size=7]
доброго времени суток!
если можете подскажите пожалуйста почему изопропанол?в чем секрет?он ведь и при выделении магнитками тоже используется а не этанол.


Affe04
Добрый вечер. Все 20 лет использовали этанол. Проходило не всегда. Но, это ф-хл. Теперь по инструкции АВ с изопропанолом. По стоимости - не критично. Зачем изопропанол - м.б. знает кто-то другой. В Маниатисе рекомендован пропанол. И в 90-х годах мы так и делали.


Русская версия Invision Power Board © 2001-2017 Invision Power Services, Inc.

© 2002-2015 Форум судебных медиков
При копировании материалов сайта размещение активной ссылки на источник обязательно!