Температуру понижайте до 30 градусов. Разброс в 5 градусов (35-40) не пойдет. Поверьте опыту, 5 градусов - это очень много. Если Вы не против, я бы хотел параллельно с ответом внести еще пару уточнений/рекомендаций:
1) Температуру советую понизить до 30. При этом контролируйте строго. Плюс-минус 5 градусов (35-40), это большая разница. При понижении температуры у Вас увеличиться время удерживания. Это обусловлено тем, что меняется вязкость Вашего элюента. Изменятся все времена удерживания, но я не думаю, что пик не будет разрешен. Сейчас же пик вполне разрешен. Вопрос только в том, что точно ли это аналит? Стандарт есть?
2) Линия через всю хроматограмму - это профиль градиента, как я понимаю? Но обратите внимание на то, что у Вас нет возврата к исходному элюенту. А это неправильно с точки зрения хроматографии. Поясню свои слова: в жидкостной хроматографии в каждый момент времени устанавливается динамическое равновесие. Поэтому для достижения максимальной воспроизводимости рекомендуется заканчивать программу всегда также, как она начинается. При этом регенерация - это где-то 2-3 объема колонки.
По самому градиенту: нет надобности уходить в очень сильный элюент, как я вижу. Т.е. все компоненты у Вас элюируются при 60% по объему сильного элюента. Кстати, здесь ацетонитрил или метанол? Вопрос принципиальный, поскольку у них разная элюирующая сила. Ацетонитрил сильнее намного, чем метанол. Кроме того, он более прозрачен в области 210 нм.
Изократика в каком по составу элюенте была? Два варианта - все могло просто вылететь не удерживаясь и все, если был сильный элюент, либо вышло только то, что не удерживается и все.
Значит еще один момент - Вы загрубили детектор или нет? Проверьте в настройках...
Итого: мой вариант для Вашей задачи, чтобы изменить картинку хроматограммы...
1) Программа элюирования: 90 буфера : 10 сильного элюента (метанол или ацетонитрил, что было по Вашей хроматограмме) 2 минуты. Потом за 2 минуты до 70:30, плато 3 минуты на ступени, потом за 5 минут идете к 30:70, плато на ступени 3 минуты, потом за 4-5 минут возвращаетесь на элюент первой ступени, плато на этом элюенте 4 минуты. Все параметры берутся с запасом, можно будет потом обрезать лишнее. Аналит искать на 2 ступени, ориентировочно... Но надежнее - по соотношениям спектральным.
2) температура - 30, либо 35 градусов (строго, без разброса в 5 градусов).
3) программу 2 раза запустить по программе в холостую, чтобы пришла в равновесие. Перед холостыми запусками на 4-5 минут на элюенте первой ступени пусть постоит для верности. Холостой запуск - вкол воды. Дистиллированной воды. Увидите заодно, нет ли артефактов каких...
4) как получите хроматограмму - дайте посмотреть
5) Колонке для установления температуры (она прогреться и внутри должна) дайте минут 15. Можете холостые погонять в это время, нормально будет.
Но если регенерации элюентом первой ступени нет - эта мягкая программа элюирования может и не помочь. Как сделаете - выложите картинку, пожалуйста, тогда будет намного проще искать ответ, если не получится эффективно разделить. Был бы препарат под рукой - сделал бы на своем хроматографе...
Были бы из одного города - с удовольствием бы помог лично, а не по форуму... Самому как-то проще все делать, чем через форум пытаться решать задачи)))