Помогите новичкам с определением каннабиноидов

Здравствуйте всем!
Помогите, пожалуйста новичкам ХТЛовским! Бьемся второй год (почти третий) с каннабиноидами. К большому сожалению только своими силами (NO средств, NO информации, NO опыта). Методика Савчука не идет, токситубы А+В эффекта не дали, дериватизация с BSTFA - результат тот же. Режимы меняли, но... в ответ тишина. TDx, бывает, дает более 1000.
Кому не жалко, кто чем может...
Agilent 6850.

Здравствуйте!
Я вот не знаю методики Савчука... Простите за серость.
Но надо как минимум полностью описать ход исследования, чтоб можно было понять где и как "не идет".
Тубы токси-лаб это прекрасно, но не увидел и не услышал, а был ли гидролиз щелочной.
Как дериватизировали с БСТФА и в чем пробу вводили в ГХ/МС.
И т.д., и т.д.

Добрый день!
Поддерживаю. Вполне вероятно, что не зная специфики дериватизации Вы допустили гидролиз БСТФА, например. Поэтому, пожалуйста, опишите процедуру, включая используемые растворители.

К сожалению наизусть не воспроизведу, боюсь ошибиться. В ближайшее время все представлю с удовольствием. Спасибо за неотказ.

[quote все представлю с удовольствием .[/quote]
Здравствуйте! Приносим извинения за долгое молчание - авральчик присутствовал!
I способ
Щелочной гидролиз:
В чистую токси-тубу 5 мл мочи+ 50% КОН ≈по 30 мкл до рН 8, закрываем крышкой.
Точно 20 мин при 700С.
Остудить до комнатной температуры.
Экстракция:
+ ≈ 70 мкл НСl конц. до рН 1-2 + 2,0 мл хлористого метилена, 10 мин. На орбитальном шейкере. Центрифугируем 10-15 мин. При 3000 об/мин. Отбираем органический слой в чистую токси-тубу, выпариваем досуха в вакуумной установке без нагревания.
Дериватизация:
+ 50 мкл BSTFA, закрываем крышкой и на 10-15 мин. При 60-700С. Переносим в виалу и закалываем 1 мкл. Перед пробой дважды закалываем чистым BSTFA (промывка).
Характеристические ионы: 488, 473, 371.
ГХ/МС-исследование.
Газовый хроматограф Agilent 6850 с масс-селективным детектором 5957С. Капиллярная колонка HP-5MS 30 м х 250мкм х 0,25 мкм. Скорость потока газа-носителя – гелия – 1 мл/мин, с делением потока (10мл/мин-?), температура колонки: начальная – 100 С (3 мин), нагрев до 300 0 С со скоростью 25 0С/мин, температура инжектора – 280 0 С, температура интерфейса 280 0С. Режим работы МСД – полное сканирование от 40 до 550 а.е.м. Идентификация по библиотеке NIST.


II способ
Щелочной гидролиз:
В чистую токси-тубу 5 мл мочи+ 10% КОН ≈ 500 мкл до рН 8-9, закрываем крышкой.
Точно 15 мин при 600С.
Остудить до комнатной температуры.
Экстракция:
+ ≈ 500 мкл НСl конц. до рН 2-3 дважды отмываем по 2,0 мл гексана (10 мин. на орбитальном шейкере. Центрифугируем 10-15 мин. при 3000 об/мин). Отбираем нижний органический слой в чистую токси-тубу, выпариваем досуха в вакуумной установке без нагревания. Растворяем в 100 мкл этилацетата и закалываем 1 мкл.


III способ:
Щелочной гидролиз:
В чистую токси-тубу 3 мл мочи+ 5н NaОН, закрываем крышкой.
Точно 20 мин при 500С.
Остудить до комнатной температуры.
Экстракция:
+ НСl конц. до рН 2-3 + 3,0 мл смеси изооктан:этилацетат 7:1., 3 мин. на орбитальном шейкере. Центрифугируем 3-5 мин. при 3000 об/мин. Отбираем верхний органический слой в чистую токси-тубу, добавляем 30 мкл р-ра ВС дифениламина в ацетонитриле конц. 20 мкг/мл, выпариваем досуха в вакуумной установке без нагревания.
Дериватизация:
+ 50 мкл РFРA и 20 мкл PFPOH, закрываем крышкой и на 15 мин. при 900С. + 70 мкл этилацетата. Переносим в виалу и закалываем 1 мкл.
ГХ/МС-исследование.
Газовый хроматограф Agilent 6850 с масс-селективным детектором 5957С. Капиллярная колонка HP-5MS 30 м х 250мкм х 0,25 мкм. Скорость потока газа-носителя – гелия – 1 мл/мин, с делением потока (10мл/мин-?), температура колонки: начальная – 100 С (1 мин), нагрев до 300 0 С со скоростью 35 0С/мин (15 мин.). Режим работы МСД – полное сканирование от 41 до 650 а.е.м. Идентификация по библиотеке NIST

После фразы "дважды вкалываем чистый БСТФА" волосы на голове встали дыбом. Кто Вам сказал делать такое???

Давно практикующие коллеги. Вроде бы сами так делают. Но почитав в форуме о дериватизации, что-то у самих закрались некоторые страшные мысли о продолжительности жизни колонки... Ищем выход. Пока на развилке...

все просто! сначала щелочной гидролиз как вы делаете, потом подкисляете и экстрагируйте дважды смесью гексан-этилацетат 7:1 миллилитра по 3, высушиваете и дереватизируете ДМСО 180мкл + ТМАН 20мкл и через пару минут 30мкл йодметана и оставляете при комнатной темперетуре минут на 20, затем экстрагируете гексаном и реконструируете этилацетатом 50мкл. и 1мкл в аппарат по вашей методе должно получиться. ионы 313, 357, 372.
И если хотите промыть колонку вколите какого нибудь растворителя ОХЧешного хотябы.

Есть еще вариант метилирования (методика во вложении, у меня воспроизводилась великолепно) мне даже больше нравится чем ТМС.

можно взглянуть на хроматограммы?

pH 8 - не маловато?
честно говоря, не задавался вопросом, хорошо это или плохо, но мы для гидролиза защелачиваем сильнее (примерно 5 мл мочи + 1 мл 10% KOH).
и гидролиз - 95 градусов 1 час.

Выйду на работу, попробую выложить - новички - всё впервые...


Будем пробовать. Спасибо!


ВСЕМ БОЛЬШОЕ СПАСИБО!!! Будем пытаться. А вот что посоветуете с библиотекой? Даёт ли NIST идентификацию производных ТГК?

Здравствуйте!
Не нужны Вам библиотеки. Определение ТГК кислоты это целевой анализ и режим работы МСД надо настраивать на конкретное определяемое вещество. Т.е. работаем в режиме селективного ионного мониторинга.

Здравствуйте всем неравнодушным!
Если получилось, то вот хроматограмма:Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Возможно, в ней и НИЧЕГО.

Здравствуйте!
Всё получилось чудесным образом.
Ваш пик 19,37 m/z 371, 473, 488.

Здравствуйте!
Пик мы находили, но вот как его "обозвать" правильно... "...тетрагидро-...силил..." нигде не видим. Возможно НЕ УМЕЕМ читать. Давать в заключении ТГК только на основании m/z 371, 473, 488???

Здравствуйте!

Какие у Вас библиотеки спектров?
В результате пишем: в моче обнаружены каннабиноиды (основной метаболит дельта-9-тетрагидроканнабинола).
Можно: в моче обнаружена 11-нор-.дельта.-9-тетрагидроканнабиноловая кислота (основной метаболит дельта-9-тетрагидроканнабинола).

Добрый вечер, вернее - доброй ночи!
У нас библиотека NIST. А по ней в данном пике одни непонятки. Написать-то можно в заключении, но возможны проверки (своя политика!) - и закономерный вопрос: и где? Есть ли где почитать более подробно? Информацию с лекций не пришьешь...

Здравствуйте!
Какая версия НИСТа? 05, 08, 11? Если надо - поделюсь кое-какими библиотеками. Но даже в 11, если мне память не изменяет, уже был 11-нор-дельта-9-ТГК-СООН, причем даже в МС/МС разделе, который небольшой совсем.
Почитать подробнее можно в статьях, их довольно много на эту тему, особенно на аглицком. Если надо - посмотрю... Да и коллеги, уверен, тоже помогут

Помощь любая принимается с превеликим удовольствием (Я не волшебник, я только учусь)! NIST 08 с обновлениями от 09 или 10, не позднее. Более ничего не имеем, а очень хочется...

И еще один вопрос: чем все-таки лучше промывку делать?

Здравствуйте!
Безводным этилацетатом.

Добрый вечер!
К выходным постараюсь загрузить библиотечки и сбросить Вам. Сегодня просто забыл флешку на рабочем месте

Добрый день всем! Приведенная выше хроматограмма была получена ранее и это был единственный удачный случай (увы!). Грешим на другую партию реактивов... Можно ли как-то попробовать "осушить" хлористый метилен, проверить на наличие воды в BSTFA??? Есть ли конкретные предпочтения при приобретении качественных реагентов?

Здравствуйте!
Можно грешить только на хлористый метилен (наличие в нем фосгена). Замените его на этилацетат или смесь гексан-этилацетат (7:1). Хлористый метилен проверьте прямым вводом в хмс, вкл детектора без задержки сканирование от 15 до 200 а.е. Там Вы и увидете все что хотите: воду, спирт, фосген и его эфиры...

Спасибо! Попробуем!

Я бы рекомендовал быть осторожным с вводом. А точнее - ввести паровую фазу (нагреть чуток) и с делением потока, дабы не перегрузить детектор (коллеги, уж простите, но у меня небольшой бзик по этому поводу Не люблю когда происходят перегрузки)

Здравствуйте!
Тут перегруз роли не играет, нас сам хлористый метилен не интересует, надо смотреть примеси.

З.Ы.: методики то приведены, а как делали? Вводили пробу в БСТФА (без упаривания) или его парили и затем в растворитель загоняли пробу. Если последние, то результат закономерный.

Пробу после гидролиза и пр. выпариваем досуха в вакуумной установке без нагревания.
Дериватизация:
в сухой остаток+ 70 мкл хлористого метилена, на вошер (несколько секунд) и + 50 мкл BSTFA, закрываем крышкой и на 10-15 мин. При 60-70 С. Переносим в виалу и закалываем 1 мкл.
???

Здравствуйте!
Хлристый метилен тут явно лишний. БСТФА 60-100 мкл будет достаточно, 30 мин - 80 гр. С.

Вчерашняя проба с этилацетатом дала результат, правда искомое было почти в самом конце списка. И на нашей улице праздник?! Спасибо всем!