Добрый день. Выделяю ДНК из костей используя PrepFiler™ BTA Forensic DNA Extraction Kits, деконтаминацию провожу сейчас препаратами содержащими органические соединения хлора (а проще говоря "Белизну" разведенную в 10 раз в течении 20-30 минут). Результаты в большинстве случаев радуют, но попались несколько косточек "проблемных": после деконтаминации, высушивания и перемалывания в порошок, при заливки ВТА-буфером происходит выделение некоего газа в смеси - выглядит так словно сода гасится уксусом. В последующем ДНК в данных образцах не наблюдается. Все эти косточки объединяет только то что они "старенькие" и хорошо высушенные, пористые. При простой заливке костного порошка из этих костей ТЕ ничего подобного не происходит. Дело именно в компонентах ВТА о составе которого я могу только гадать. Бывало ли у кого подобное? как справлялись? Я понимаю что стоило бы попробовать классический фенольный метод, но наша лаборатория от него отошла и для его возрождения понадобятся дополнительные усилия и реактивы. Заранее благодарен за любые советы и идеи.
pH у BTA буфера слабощелочной, белизна сильно щелочная, т.е. о соде с уксусом речь не идет. В составе БТА есть гуанидин изотиоцианат, а вот он как раз может вступать в реакцию и с щелочами и с кислотами с выделением газа (поэтому их запрещено в отходы с ГИТЦ сливать). Единственное, что могу посоветовать - тщательнее промывать кости после белизны, возможно из-за пористой структуры она в них задерживается.
Спасибо, это было одно из предположений - потому и писал что кости пористые. Насчет уксуса и соды - это был пример. Никогда не пробовал проверить рН ВТА (возможно зря), у него точно слабощелочная реакция? Вы не знаете примерный состав? Главная задача буфера декальцинизация и протеолиз, а вот что именно работает в качестве декальцинизатора? (врядли банальный ЕДТА, былоб слишком просто)
pH 8.1, буфер содержит лошадиную дозу EGTA (в отличие от EDTA имеет большее сродство к кальцию), благодаря чему и происходит деминерализация.
Помимо ЕГТА и ГИТЦ, содержится также саркозил, и наверняка какая-нибудь соль типа хлорида натрия и ТРИС тоже скорее всего. Больше там ничего особенного вроде нет. Кроме ГИТЦ ничего не должно пызыри давать.