Способ выделения ДНК из гистопрепаратов.

Уважаемые коллеги! Каким способом лучше всего выделять ДНК из фиксированных тканей, залитых в парафиновые блоки?

Есть метод разработанный ФГУ РНЦПХТ(RU 2351632).
Из парафиновых блоков делают срезы толщиной 20 мкм. К срезу добав.100мкл 0,5%вод.р-р Твин20, затем смест нагревают при +90С в теч.15мин.далее добав.50мкл.протеиназы К при+55С и ежечасно взбалтываем,после этого добавляют реагенты:
100мкл 5%водн.раствор Челекс100 и по 5 мкл водн.р-ры 0,5 М Трис с РН 8,0 и 1М ЭДТА С РН 8,0 и нагреваем до+ 100С в теч.15 мин.и полученный р-р центрифугируем при 10500об/мин.Затем охлаждаем при t-1С в теч.5 мин. Затем удаляем застывший слой парафина стерильным наконечником, остатки нагреваем с хлороформом при t+45C, затем центрифугируем при 10500 об/мин.в теч.15 мин., 200мкл.супернатанта перенесли в стерильн.пробирку+добав.к нему 5мкл.5М водного р-ра хлористого натрия + 500 мкл абсолют.этил.спирта.после этого центрифугируем при 10500об/мин.в теч.30 мин.при t +4C и верхний слой удаляем, а к осадку добавляют 100мкл 80% этил.спирта. И вновь центрофуируем при 10000об/мин.при t+4C, заткм верхний слой удаляют , а нижний слой высушивают при t +65C в теч.10 мин.Затем растворяют его в 30мкл в бидистмлиров.воде И этот раствор используют дляПЦР т.к.раствор содержит ДНК..На электрофорезе в агарозном поле обнаружены амплифицированные фрагменты соответствующих размеров от90 и 200 нуклеотидов соответственно, чио зарактеризуют высоко качество ДНК.И имееь преимушество в 1,5 и 2 раза чем в прототипе)И обеспечивает высокии выход качественного ДНК.И получены из всех 100%срезов. Ныне ни один известные методы в мире так не обеспечивает выход ДНК для ПЦР. Способ разработан ФГУРНЦРХТ( RU)

Огромное спасибо!!!
P.S. Сам ничего не понял, но жена сказала, что так и должно быть, потому что генетик она, а я так - медкрим ...

Я гистолог...смотрю никто 2 дня не реагирует..специально для общего дела листал все и нашел у Великой России у Россиских ученых в ФГУ РНЦПХТ. С ув.

А Prepfiler с предварительной обработкой ксилолом хуже работает? Сама не пробовала, но говорят, что Днк выделяется в достаточном количестве.

Другими известными методами выделение ДНК где то 63 %выделялись.т.к.гистопроводка проводится в основном на этил.спирте разной концентрации и хлороформе и ксилоле, которые могут фрагментировать молекул ДНК..с учетом этих минусов ФГУ РНЦПХТ RU при исследовании по онкомаркерам для ПЦР по опухолям простаты ,разработали и запотентовали вышеуказанную методику.

Спасибо! А как приготовить 0,5% р-р твин 20?

В РФ наркоконтроль запретил.

Это всерьез что-ли? В лабраториях нельзя хлороформ использовать??
Вот Qiagen с Zymo и Ко образуются, все на колонки перейдут

@ТС
Кстати, можете посмотреть сайты названных производителей, у них полно китов для выделения из FFPE, по отзывам очень неплохо работающих. Российский Evrogen также похожие выпускает.

Возможно, перешли на изопропиловый спирт, где заменяет этил.спирт и хлороформ с прибавкой поверхностно активных веществ кажется.


Эти киты не по карманам возможно...А хлороформ еще использует, где нужно.

Ув. Доктор, Вам конечно простительно быть не в курсе как не генетику, но большинство классических молбиол протоколов предполагает использование хлороформа для выделения нукл. кислот. Как без него обходится, если на колонки нет денег, я вообще не представляю...

Заменили на ксилол.


В гист.-запрет.У начальства есть бумаги на это счёт.Точно не помню,но 2 или 3 года без хлороформа гист.проводка.


Да.

Ну, для депарафинизации хлороформ не очень-то и нужен, достаточно ксилола и спирта, по кр. мере при выделении ДНК. Хлороформ нужен чтобы от фенола избавляться в других протоколах.

Ув.Медик, у нас как то хлороформ был в списке прекурсоров, но в последние лет 5 у нас приказах снято. Мы то от РФ все берем ...же.
Ув.genosys, я понял Вас. Я на счет гистпроводки имел ввиду. А так для выделения ДНК да много чего нужно для рутинной работы и качественного и количественного выделения ДНК...
Ув.ТС кажется Твин 20 готовые импортные есть ...

Спасибо Вам за подсказку. Хлороформ нужен и для гистопроводки для депарафинизации и для генетиков для выделения Нуклеокислот...т.к.хорошо разрушает мембрану клеток и раздражительно действует на молекулу ДНК....т.е.может фрагментировать ядер клеток и т.д....

Роль хлороформа не столько в разрушении мембран и пр., сколько в улучшении разделения фаз и удалении остатков фенола на последнем этапе. Заменить его можно бромхлорпропаном, если его тоже в список прекурсоров еще не внесли

Хорошо хлороформом( еще Г-25 Софадексом) удалять остатки фенола при фенольной денатурации белков(нук.кислот.)