Способ выделения ДНК из гистопрепаратов.



Форум судебных медиков России > Судебная медицина и судебно-медицинская экспертиза > Судебно-медицинская генетика
sasa_vz
Уважаемые коллеги! Каким способом лучше всего выделять ДНК из фиксированных тканей, залитых в парафиновые блоки?


доктор морфолог
Цитата(sasa_vz @ 26.09.2015 - 00:59)
Уважаемые коллеги! Каким способом лучше всего выделять ДНК из фиксированных тканей, залитых в парафиновые блоки?

Есть метод разработанный ФГУ РНЦПХТ(RU 2351632).
Из парафиновых блоков делают срезы толщиной 20 мкм. К срезу добав.100мкл 0,5%вод.р-р Твин20, затем смест нагревают при +90С в теч.15мин.далее добав.50мкл.протеиназы К при+55С и ежечасно взбалтываем,после этого добавляют реагенты:
100мкл 5%водн.раствор Челекс100 и по 5 мкл водн.р-ры 0,5 М Трис с РН 8,0 и 1М ЭДТА С РН 8,0 и нагреваем до+ 100С в теч.15 мин.и полученный р-р центрифугируем при 10500об/мин.Затем охлаждаем при t-1С в теч.5 мин. Затем удаляем застывший слой парафина стерильным наконечником, остатки нагреваем с хлороформом при t+45C, затем центрифугируем при 10500 об/мин.в теч.15 мин., 200мкл.супернатанта перенесли в стерильн.пробирку+добав.к нему 5мкл.5М водного р-ра хлористого натрия + 500 мкл абсолют.этил.спирта.после этого центрифугируем при 10500об/мин.в теч.30 мин.при t +4C и верхний слой удаляем, а к осадку добавляют 100мкл 80% этил.спирта. И вновь центрофуируем при 10000об/мин.при t+4C, заткм верхний слой удаляют , а нижний слой высушивают при t +65C в теч.10 мин.Затем растворяют его в 30мкл в бидистмлиров.воде И этот раствор используют дляПЦР т.к.раствор содержит ДНК..На электрофорезе в агарозном поле обнаружены амплифицированные фрагменты соответствующих размеров от90 и 200 нуклеотидов соответственно, чио зарактеризуют высоко качество ДНК.И имееь преимушество в 1,5 и 2 раза чем в прототипе)И обеспечивает высокии выход качественного ДНК.И получены из всех 100%срезов. Ныне ни один известные методы в мире так не обеспечивает выход ДНК для ПЦР. Способ разработан ФГУРНЦРХТ( RU)


sasa_vz
Огромное спасибо!!!
P.S. Сам ничего не понял, но жена сказала, что так и должно быть, потому что генетик она, а я так - медкрим smile.gif ...


доктор морфолог
Цитата(sasa_vz @ 27.09.2015 - 00:37)
Огромное спасибо!!!
P.S. Сам ничего не понял, но жена сказала, что так и должно быть, потому что генетик она, а я так - медкрим smile.gif ...

Я гистолог...смотрю никто 2 дня не реагирует..специально для общего дела листал все и нашел у Великой России у Россиских ученых в ФГУ РНЦПХТ. С ув.


Venerdi
Цитата(доктор морфолог @ 27.09.2015 - 09:25)
Я гистолог...смотрю никто 2 дня не реагирует..специально для общего дела листал все и нашел у Великой России у Россиских ученых в ФГУ РНЦПХТ. С ув.


А Prepfiler с предварительной обработкой ксилолом хуже работает? Сама не пробовала, но говорят, что Днк выделяется в достаточном количестве.


доктор морфолог
Цитата(Venerdi @ 27.09.2015 - 15:53)
А Prepfiler с предварительной обработкой ксилолом хуже работает? Сама не пробовала, но говорят, что Днк выделяется в достаточном количестве.

Другими известными методами выделение ДНК где то 63 %выделялись.т.к.гистопроводка проводится в основном на этил.спирте разной концентрации и хлороформе и ксилоле, которые могут фрагментировать молекул ДНК..с учетом этих минусов ФГУ РНЦПХТ RU при исследовании по онкомаркерам для ПЦР по опухолям простаты ,разработали и запотентовали вышеуказанную методику.


Venerdi
Цитата(доктор морфолог @ 27.09.2015 - 15:25)
Другими известными методами выделение ДНК где то 63 %выделялись.т.к.гистопроводка проводится в основном на этил.спирте разной концентрации и хлороформе и ксилоле, которые могут фрагментировать молекул ДНК..с учетом этих минусов ФГУ РНЦПХТ RU при исследовании по онкомаркерам для ПЦР по опухолям простаты ,разработали и запотентовали вышеуказанную методику.

Спасибо! А как приготовить 0,5% р-р твин 20?


Медик
Цитата(доктор морфолог @ 27.09.2015 - 16:25)
хлороформе

В РФ наркоконтроль запретил.


genosys
Цитата(Медик @ 27.09.2015 - 19:42)
В РФ наркоконтроль запретил.

Это всерьез что-ли? В лабраториях нельзя хлороформ использовать?? wacko.gif
Вот Qiagen с Zymo и Ко образуются, все на колонки перейдут wink.gif

@ТС
Кстати, можете посмотреть сайты названных производителей, у них полно китов для выделения из FFPE, по отзывам очень неплохо работающих. Российский Evrogen также похожие выпускает.


доктор морфолог
Цитата(Медик @ 27.09.2015 - 23:42)
В РФ наркоконтроль запретил.

Возможно, перешли на изопропиловый спирт, где заменяет этил.спирт и хлороформ с прибавкой поверхностно активных веществ кажется.

Цитата(genosys @ 28.09.2015 - 00:07)
Это всерьез что-ли? В лабраториях нельзя хлороформ использовать?? wacko.gif
Вот Qiagen с Zymo и Ко образуются, все на колонки перейдут wink.gif

@ТС
Кстати, можете посмотреть сайты названных производителей, у них полно китов для выделения из FFPE, по отзывам очень неплохо работающих. Российский Evrogen также похожие выпускает.

Эти киты не по карманам возможно...А хлороформ еще использует, где нужно.


genosys
Цитата(доктор морфолог @ 27.09.2015 - 20:20)
Возможно, перешли на изопропиловый спирт, где заменяет этил.спирт и хлороформ с прибавкой поверхностно активных веществ кажется.

Ув. Доктор, Вам конечно простительно быть не в курсе как не генетику, но большинство классических молбиол протоколов предполагает использование хлороформа для выделения нукл. кислот. Как без него обходится, если на колонки нет денег, я вообще не представляю...


Медик
Цитата(доктор морфолог @ 27.09.2015 - 22:20)
хлороформ

Заменили на ксилол.

Цитата(genosys @ 27.09.2015 - 22:07)
В лабраториях нельзя хлороформ использовать??

В гист.-запрет.У начальства есть бумаги на это счёт.Точно не помню,но 2 или 3 года без хлороформа гист.проводка.

Цитата(genosys @ 27.09.2015 - 22:07)
Это всерьез что-ли?

Да.


genosys
Цитата(Медик @ 27.09.2015 - 20:51)
Заменили на ксилол.
В гист.-запрет.У начальства есть бумаги на это счёт.Точно не помню,но 2 или 3 года без хлороформа гист.проводка.

Ну, для депарафинизации хлороформ не очень-то и нужен, достаточно ксилола и спирта, по кр. мере при выделении ДНК. Хлороформ нужен чтобы от фенола избавляться в других протоколах.


доктор морфолог
Ув.Медик, у нас как то хлороформ был в списке прекурсоров, но в последние лет 5 у нас приказах снято. Мы то от РФ все берем ...же.
Ув.genosys, я понял Вас. Я на счет гистпроводки имел ввиду. А так для выделения ДНК да много чего нужно для рутинной работы и качественного и количественного выделения ДНК...
Ув.ТС кажется Твин 20 готовые импортные есть ...


доктор морфолог
Цитата(genosys @ 28.09.2015 - 00:24)
Ув. Доктор, Вам конечно простительно быть не в курсе как не генетику, но большинство классических молбиол протоколов предполагает использование хлороформа для выделения нукл. кислот. Как без него обходится, если на колонки нет денег, я вообще не представляю...

Спасибо Вам за подсказку. Хлороформ нужен и для гистопроводки для депарафинизации и для генетиков для выделения Нуклеокислот...т.к.хорошо разрушает мембрану клеток и раздражительно действует на молекулу ДНК....т.е.может фрагментировать ядер клеток и т.д....


genosys
Цитата(доктор морфолог @ 28.09.2015 - 03:21)
Спасибо Вам за подсказку. Хлороформ нужен и для гистопроводки для депарафинизации и для генетиков для выделения Нуклеокислот...т.к.хорошо разрушает мембрану клеток и раздражительно действует на молекулу ДНК....т.е.может фрагментировать ядер клеток и т.д....

Роль хлороформа не столько в разрушении мембран и пр., сколько в улучшении разделения фаз и удалении остатков фенола на последнем этапе. Заменить его можно бромхлорпропаном, если его тоже в список прекурсоров еще не внесли smile.gif


доктор морфолог
Цитата(genosys @ 28.09.2015 - 16:51)
Роль хлороформа не столько в разрушении мембран и пр., сколько в улучшении разделения фаз и удалении остатков фенола на последнем этапе. Заменить его можно бромхлорпропаном, если его тоже в список прекурсоров еще не внесли smile.gif

Хорошо хлороформом( еще Г-25 Софадексом) удалять остатки фенола при фенольной денатурации белков(нук.кислот.)


Русская версия Invision Power Board © 2001-2017 Invision Power Services, Inc.

© 2002-2015 Форум судебных медиков
При копировании материалов сайта размещение активной ссылки на источник обязательно!