Здравствуйте. Обращаюсь к профессионалам, т.к. сам уже не знаю... Начал заниматься, будучи в аспирантуре, тимусом, и столкнулся с ситуацией, что препараты после проводки получаются "пересушенными", неоднократно корректировал нахождение в спиртах, хлороформах и парафинах, но воз и ныне там... Ситуация осложняется ещё и тем, что эксперимент ставлю на крысах, и ткань ведёт себя иначе чем человеческая. Привожу несколько вариантов из тех, что пробовал 1) 50,60,70,80,90,96,100 спирты -- по 2 часа. Далее спирт/хлороформ 2:1, 1:1, 1: 2 -- по 45 мин. Затем хлороформ 1-й и 2-й -- по 30 мин. Потом хлороформ/парафин -- 1 час. Далее парфины 1-й,2-й,3-й -- по 30 минут.
2) 50,60,70,80,90,96,100 спирты -- по 1 часу. Далее спирт/хлороформ 2:1, 1:1, 1: 2 -- по 30 мин. Затем хлороформ 1-й и 2-й -- по 20 мин. Потом хлороформ/парафин -- 45 мин. Далее парфины 1-й,2-й,3-й -- по 30 минут.
3) 50,60,70,80,90,96,100 спирты -- по 1 часу. Далее спирт/хлороформ 2:1, 1:1, 1: 2 -- по 20 мин. Затем хлороформ 1-й и 2-й -- по 20 мин. Потом хлороформ/парафин -- 30 мин. Далее парфины 1-й,2-й,3-й -- по 20 минут.
4) 50,60,70,80,90,96,100 спирты -- по 1 часу. Далее спирт/хлороформ 1:1 -- 20 мин. Затем хлороформ -- 20 мин. Потом хлороформ/парафин -- 20 мин. Далее парфины 1-й,2-й -- по 20 минут.
В итоге препараты получались вначале вообще как "сухарики", трескались и "высыпались" со стекла. А в последнем варианте картина была менее выражена, но, тем не менее, весь препарат потрескавшийся и "порванный"...
Фиксация препаратов производилась в р-ре нейтрального 10% формалина.
Уже не знаю что делать. Ещё уменьшать время нахождения по реактивам?.. Посоветуйте пожалуйста.
ЕвгенийЙ
23.06.2016 - 11:09
P.S.: заливка в блок производилась парафин:воск:каучук=20:5:1 смесью.
доктор морфолог
23.06.2016 - 13:22
Цитата(ЕвгенийЙ @ 23.06.2016 - 13:49)
В итоге препараты получались вначале вообще как "сухарики", трескались и "высыпались" со стекла. А в последнем варианте картина была менее выражена, но, тем не менее, весь препарат потрескавшийся и "порванный"...
Одним словом, крошатся парафин? Причина: - слишком твердый - медленно охлаждался при заливке - низкая температура окружающей среды - большой угол наклона ножа. Устранение: - подышать на парафиновый блок - изменить наклон ножа - перезалить обьект
ЕвгенийЙ
23.06.2016 - 15:03
Я вероятно непонятно описал свою проблему.
Моя проблема в том, что не парафин крошится, он как раз достаточно пластичный из-за добавленного воска. Трескается сам препарат, при микроскопии видны разрывы в самой ткани. Есть подозрение, что я его в каком-то из реактивов передерживаю по времени. Но я не могу понять, то ли это спирты, то ли хлороформы, то ли в чём ещё проблема.
Я ещё грешил, что нож тупой. Пробовал одноразовыми лезвиями -- эффект тот же -- линейные разрывы ткани. Внешне выглядит как просто пересохла и потрескалась.
Надежда Ивановна
23.06.2016 - 22:48
В спиртах пересушиваете. Завтра на работе посмотрю схему проводки.
доктор морфолог
24.06.2016 - 06:57
Пересушили на спиртах, нужно пробовать резать поместив на него кусочек льда( довели до обезвоживания). На пока такая версия остается.
ЕвгенийЙ
24.06.2016 - 11:37
Спасибо большое за помощь.
Надежда Ивановна
24.06.2016 - 19:27
Цитата(ЕвгенийЙ @ 24.06.2016 - 12:37)
Спасибо большое за помощь.
Простите, обещание относительно протокола проводки не выполнила, в понедельник обязательно пришлю протокол проводки специально для органов иммунной системы крыс и мышей.
Медик
24.06.2016 - 23:04
Цитата(Надежда Ивановна @ 24.06.2016 - 20:27)
в понедельник обязательно пришлю протокол проводки специально для органов иммунной системы крыс и мышей.
Схемы проводки органов иммун.системы курей у Вас случайно нет ?
доктор морфолог
25.06.2016 - 08:04
Цитата(Медик @ 25.06.2016 - 02:04)
Схемы проводки органов иммун.системы курей у Вас случайно нет ?
специально у нас нет пока м.б.ноухау у иных медицин?
Надежда Ивановна
26.06.2016 - 13:52
Проводка для органов иммунной системы крыс и мышей. В нашей лаборатории данная проводка осуществляется в автомате карусельного типа, по сути, это автоматизированный тип ручной проводки. С уважением Надежда Ивановна
Реактив Экспозиция Температура
70 % спирт 1 час комнатная 80% спирт 1 час комнатная 96 % спирт I 1 час комнатная 96 % спирт II 1 час комнатная Абсолютный спирт I 1 час комнатная Абсолютный спирт II 30 минут комнатная Абсолютный спирт – хлороформ (1:1) 30 минут комнатная Хлороформ I 1 час комнатная Хлороформ II 1 час комнатная Парафин I 1 час 58 ˚С Парафин II 1 час 58 ˚С
ЕвгенийЙ
30.06.2016 - 10:48
Спасибо большое за помощь, буду пробовать.
ЕвгенийЙ
5.07.2016 - 14:37
Подскажите ещё пожалуйста: до проведения по батарее вы материал фиксировали в 10% формалине или в жидкости Буэна?
И может ли фиксация в формалине также быть причиной того, что тимус "пересушивается"?
Надежда Ивановна
4.08.2016 - 18:18
Цитата(ЕвгенийЙ @ 5.07.2016 - 15:37)
материал фиксировали в 10% формалине или в жидкости Буэна? И может ли фиксация в формалине также быть причиной того, что тимус "пересушивается"?
Образцы тканей фиксируем в 10% нейтральной формалине, фиксация в формалине не является причиной пересушивания тканей.