Генетические методы работы (следы спермы)

Подготовка к анализу смешанных следов биологического материала в экспертизах, назначенных по поводу преступлений, совершённых на сексуальной почве.
Преступления, совершаемые на сексуальной почве, составляю достаточно большой процент от суммы всех преступлений. При расследовании такого рода преступлений одним из основных факторов является обнаружение и, что несомненно более важно, идентификация спермы, оставленной преступником на вещественных доказательствах и/или теле жертвы. Методов обнаружения спермы много, основными до сих пор остаются: микроскопический анализ окрашенных препаратов, биохимический (кислая фосфатаза (PAP), специфический антиген простаты (PSA) или Р30) , и физический (ультрафиолетовый свет длиной 254 и 365 нм). Прикрепляю статью, в которой сравниваются два метода поиска спермы. Нажмите для просмотра прикрепленного файла Далее, идентификация целесообразна с применением технологии ДНК-типирования. Для этого необходимо разделить сперматозоиды и любые другие клетки, которые неизбежно присутствуют в смешанных следах, таких как тампоны с содержимым влагалища жертвы, тампоны с содержимым прямой кишки, ротовой полости. Процесс разделения в разные фракции сперматозоидов и других клеток (эпителиальные клетки разных типов, клетки крови) называется дифференциальным лизисом. Дифференцирование построено на том факте, что оболочки сперматозоидов значительно устойчивее к действию различных разрушающих факторов, чем большинство оболочек других клеток. Чтобы «добраться» до ядра клетки, которое и содержит необходимую для анализа ДНК, требуется разрушить клеточные оболочки. Эту работу выполняет специально добавляемый в реакцию энзим – Протеиназа К. Однако, если клетки эпителия и крови легко разрушаются под действием протеиназы К, то головки сперматозоидов выдерживают атаки этого фермента, по крайней мере, в течение двух часов без особого вреда для себя. Это явление объясняется наличием в белковой мембране сперматозоидов прочных химических связей, так называемых дисульфидных мостиков. Таким образом, если к смеси сперматозоидов и других клеток добавить протеиназу К и инкубировать при определённой температуре (37, а лучше 56 градусов) в течение 60-120мин, то можно рассчитывать, что все клетки кроме сперматозоидов окажутся лизированными, то есть, перейдут в раствор. Далее следует центрифугирование, после которого головки сперматозоидов оказываются в осадке. Надосадочную жидкость (супернатант) целесообразно использовать для генетического анализа, во-первых, для того, чтобы убедиться в происхождении тампона от жертвы, во-вторых, иногда, в этой фракции могут оказаться клетки насильника (эпителий, кровь). Осадок же сперматозоидов представляет собой обогащённую, а иногда и «абсолютно» чистую фракцию сперматозоидов насильника. Кстати, проверить на «чистоту» эту фракцию, также как и фракцию эпителиальную, можно, поставив генетический тест установления половой принадлежности. Дальнейший генетический анализ также способен установить смешанный характер следов и доказательно вычленить вкладчиков. Схематически дифференцирующий лизис приводится на рисунке. Остаётся одна проблема: как же разрушить неуязвимые головки сперматозоидов и извлечь из них так нужную для анализа ДНК? Для этого к отмытым несколько раз головкам сперматозоидов добавляется специальный реагент – дитиотрейтол (ДТТ), который разрушает дисульфидные связи и позволяет новой порции протеиназы К довершить лизис. Далее следуют процедуры очистки ДНК, подготовки её к анализу и сам молекулярно-генетический анализ.

Каким образом оптимально выделить ДНК из эпителиальной фракции при дифлизисе? Результат довольно часто плачевен, приходится концентрировать, менять время инъекции и т.д. Заранее благодарю за помощь и советы.

Уважаемый 'квик'! Обычно проблем с эпителиальной фракцией не бывает. В любом тампоне из-зи соприкосновения с эпителиальной тканью наблюдается подавляющее количество клеток эпителия жертвы. Вопрос зачастую стоит о том, как развести избыток ДНК, полученной в составе эпителиальной фракции.Бывают случаи, когда именно в эпителиальную фракцию попадают клетки, характерные для насильника (не головки сперматозоидов, а другие клетки спермы). Тогда важно подобрать разведение так, чтобы ДНК жертвы не зашкаливала, а малое количество ДНК насильника - всё же можно было выявить. Выделение может быть проведено классическим способом фенол-хлороформной экстракции с последующим переосаждением спиртом.
Всего наилучшего.

Уважаемый "Зубр"! На самом деле с моей стороны не совсем точно поставлен вопрос. речь не о тампонах, а, например, о презервативе, где слишком много спермы, а женщина практически не определяется. Попытка из "женской" фракции дифлизиса выделить генотип жертвы зачастую не приносит успеха из-за преобладающего мужского компонента. Может быть. есть какие-либо способы из подобных объектов получить хотя бы нормальный смешнный профиль? И, если Вас не затруднит, посоветуйте, каким образом в смешанных пятнах (2 компонета, мужской и женский), попробовать определить относительное соотношение этих компонентов? (по высоте (площади) Х и У как-то не совсем соответствует). Спасибо!

Уважаемый 'квик'! Прежде всего, если искомого женского материала в смешанных следах всё же такое количество, которое методом ПЦР способно превратиться в диагностируемое, то этому не помешает и 1000-кратное преобладание мужского компонента. Это касается и ПААГ электрофореза (окраска серебром) и, тем более, автоматизированного капиллярного электрофореза. Отношение же мужского и женского компонентов в смеси достоверно можно оценить с помощью ПЦР в реальном времени. Другие способы слишком приблизительны.
Всего наилучшего.

Уважаемый "Зубр"! Даже 50-кратное преобладание мажорного компонента, к сожалению, не позволяет, получить нормальный смешанный профиль (смеси читаемы только в коротких локусах). Тем более при помощи автоматизированного капиллярного электрофореза (как ни странно, ПААГ в данном случае более информативен). Данное выскзывание основано на результатах многочисленных проведенных экспериментов, в том числе с оценкой количества ДНК обоих компонентов при помощи real-time (как human, так и у). Если Вы сочтете возможным, большая просьба поделиться мнением о двойном (h/y) наборе duo для параллельного определения человеческой ДНК и ДНК мужского генетического пола. Благодарю заранее за ответ и помощь.

Доброго времени суток уважаемые форумчане! Не в продолжение дискуссии по данной теме, но непосредственно к теме относящееся позвольте представить.
Приведу реальный пример установления генотипа в случае полового преступления смешанной пробы биоматериала, включающего в себя эпителиальные клетки потерпевшей и клетки спермы. Особенности доставленных вещественных доказательств таковы. Есть только предметное стекло с мазком из влагалища потерпевшей. При первичных судебно-биологических исследованиях в этом материале была зафиксирована семенная жидкость по реакции на наличие специфического антигена простаты, свойственного мужчине, методом СЕРАТЕК СЕМИКВАНТ (Германия). Микроскопически головок сперматозоидов выявлено не было. Мы смывали всё, что есть на стекле и получали тотальный препарат ДНК. Дифференцирующий лизис, в данном случае, не помог бы – головок сперматозоидов не обнаружено. Для анализа применяли Identifiler и автоматизированный анализатор ДНК – всё корпорации Апплера, США. Дополнительные генетические признаки получены по всем 15 STR системам анализа (кроме тех случаев, где они совпали с признаками потерпевшей, которые представлены более сильно). На рисунке 1 и рисунке 2 представлены результаты генотипирования по одной системе на каждом рисунке (системы D7S820 и D16S539). На рисунке 3 – половая принадлежность (амелогенин) – наблюдается присутствие мужской Y - хромосомы и ещё две системы D5S818 и FGA. Везде в смешанном пятне выявлен генотип потерпевшей и генотип подозреваемого. Данными и дальнейшими исследованиями с применением 17 STR систем анализа, локализованных на Y-хромосоме, получены серьёзные доказательства наличия на стекле материала подозреваемого, и следовательно, причастности подозреваемого к данному преступлению.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла Нажмите для просмотра прикрепленного файла Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Всем привет.