[Провизор]

Уважаемый KSS17. Я в полне понимаю, что говорю и пишу соответственно. Я все внимательно прочитала, и не думайте, что ничего не поняла. рКа и липофильность несомненно важные факторы при экстракции. Но вы наверное читали мое сообщение, где я писала, что для меня является определяющим фактором СВЯЗЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ВЕЩЕСТВА С БЕЛКОМ. Конечно подобрав какое-нибудь вещество я несомненно посмотрю на его рКа (определю какое извлечение мне делать - кислое или щелочное), и подберу соответствующий экстрагент для извлечения. Но как все это может повлиять на степень связывание, а не согласиться с тем, что лекарственные вещества связываются в крови с альбумином вы не можете. На связывание влияют сопутствующие заболевания, совместное присутствие нескольких веществ, в конце концов пол, но никак не кислотность или основность. Липофильные вещества свяжутся в основном с липопротеинами, но большинство лекарственных веществ являются гидрофильными (я не беру в расчет пестициды и хлорорганику, которые имеют сродство к жировой ткани).
Согласитесь, что все существующие методики изолирования из крови - метод прямой экстракции из крови; после гемолиза; использование осаждающих агентов (ТХУ, вольфрамат натрия в присутствии серной кислоты); использование высаливающего агента (насыщенный раствор аммония сульфата) - выделяют только свободную фракцию вещества. А если лекарственное вещество связывается на 98%или токсическое вещество используется в малых дозах, то как быть в этой ситуации. При использовании всех методов будут потери, которые могут достигать 10%. И получается, что отравление есть, а чем человек отравился не известно. Вы сможете мне возразить, что при длительном приеме происходит кумуляция токсического вещества, но это тоже не аргумент против моих доводов.
На счет ТФЭ. Несомненно новый и перспективный метод. Я мало, что знаю по этому поводу. Но мне кажется, что она больше используется для очистки и концентрирования экстрактов на картраджах. Но ак с помощью нее разорвать связь мне непонятно. К моче, возможно, это применимо, но на счет крови я сомневаюсь, ведь связи тем прочные, кроме того введение некоторых радикалов в молекулу вещества упрочняет связь. Если у вас есть по этому поводу какие-то мысли, то буду признательна и внимательно все выслушаю. Возможность сравнить методы есть, обязательно все сделаю. Если я не права, то признаю свою неправоту.
Речь идет скорей всего не а скрининге методика, а о ее валидации (т.е. соответствии данной методики все критериям - правильности, сходимости, воспроизводимости, пригодности системы и т.д.).
Что касается публикаций по статистике. На сколько я знаю в СПб в бюро и областном и городском ведутся отчеты по веществам встречающимся при анализеИ в наркодиспансере тоже. А в городском бюро раньше учитывали и комбинации встречающихся веществ. С этим они мне обещали помочь, и от вас я хотела тоже самого (т.е. чем сейчас травятся). Но я не понимаю почему такой простой вопрос загнал всех в тупик, и развернул такую бурную полемику.
Да а еще товарищ KSS17 я вам хотела сказать, что надо как-то проше быть в общении. Я абсолютно не сомневаюсь в ваших знаниях и жизненном опыте, я даже подозреваю, что вы давно работаете в этой области, но если человек не прав, то нужно корректно сказать об этом, а не нападать на него. Я только начинающий специалист и пока действую методом проб и ошибок. Если я вас как-то задела, то извините это не со зла.

[KSS17]

Здравствуйте!
Да я неагрессивный… И как раз пытаюсь Вам помочь, но Вы как-то упёрлись в связь с белками. Любое извлечение это совокупность факторов и нельзя рассматривать одну часть без других.
Что касаемо задевших Вас за живое рКа и липофильности, так я это к тому сказал, чтоб Вы могли сделать грамотный выбор модельных соединений для своей работы.
Хороший подход разрушения связи лекарство-белок это кислотный гидролиз, т.е. формально нет белка, нет связи… Ещё вариант, разбавление образца крови.
Связь лекарство-белок не является прочной, и применение ТФЭ с использованием смешанной фазы (одна из которых, например, катионит) позволяет получать высокие выходы целевых компонентов за счёт обменных процессов.
И не надо на меня дуться, я понимаю, что Вы то, что вложено в Вас руководителем (СВЯЗЬ ЛЕКАРСТВЕННОГО ВЕЩЕСТВА С БЕЛКОМ)…
Обращайтесь, чем сможем, тем поможем.
А к чему Вам статистика мне всё равно не понятно… Ведь та цель, которую Вы заявляете, как раз должна охватывать обширный круг соединений, а Вы просите назвать частности.

Сообщение отредактировал KSS17 - 27.11.2009 - 23:24

[Провизор]

Наконец-то разговор с вами, уважаемых KSS17, более менее стал получаться. На счет того, что я плод своего руководителя, вы ошибаетесь. Он менее компитентен в этом вопросе, чем я.
Кислотный гидролиз это конечно хорошо, но не выход. Во-первых он идет в жестких условиях (рН=2, 100 С). Белок свернется, но вы не думаети, что на его поверхности соосядет ТВ и будут потери. А во-вторых некоторые лекарственные вещества подвергнуться гидролизу при таких условиях и мы увидет только его разрушенную часть.
Разбавить кровь. А вы конкретно чем предлагаете? Водой. В этих условиях разрушаться только эритроциты (произойдет их гемолиз), а белки как были так и остануться.
С ТФЭ согласна, может это и выход (просто я как-то не думала на счет этого). Я обязательно подумаю и попробую.
Да кстати, я на вас не дуюсь, а все принимаю к сведению. Просто вы тоже будьте аккуратны в своих высказываниях. Спасибо за помощь и понимание.

[Dr_Bob]

Попробуйте изолировать смесь АКФАД (которую как диагностический эталон каждой токс. методики рекомендовала доц. Вечеркова - см. Veсerkova, J. Postupy pri zachytu a identifikaci leciv a jejich metabolitu v biologickem
materiali. Praha: SPN, 1983.): Атропин, Кодеин, Фенметразин, Амидопирин, Диазепам.
Конкретную пропись составляющих АКФАД (навески, концентрации) не знаю, я не токсиколог, но могу спросить у наших девчат из лаборатории.
Если методика пойдет с АКФАДом - значит это хорошая методика.
Но я не верю, что смешиванием исследуемых веществ (аналитов) с кровью in vitro вы достигнете такой же тип и силу связи с белками плазмы, как в живом организме (in vivo). Это не есть "чистый" эксперимент. Другое дело - вводить смеси исследуемых веществ напр. собакам (парентерально или per os с едой) а потом брать у них кровь на изолирование и дальнейшее токсикологическое исследование.

[KSS17]

Наконец-то разговор с вами...

Здравствуйте!
Гидролиз позволяет разрушить связи с белком (т.к. это, как правило, водородные связи и ионные), да потери будут для высоколипофильных веществ кислой и нейтральной природы. Мы им пользуемся на практике и пока не жалеем, в этом плане прямая экстракция из крови однозначно уступает.
Разбавление увеличивает свободную фракцию аналита, т.к. связывание с белком это равновесный процесс…
А кто Вам сказал, что продукты гидролиза плохие маркеры для идентификации веществ? И продукты гидролиза и даже артефакты при ГХ исследовании позволяют выявлять ряд лекарственных и токсических веществ при анализе биологических образцов. Причём самым распространенным методом идентификации бензодиазепинов является определение продуктов их гидролиза (аминобензофенонов), к тому же он ещё высокоспецифичный и чувствительный.
А внимание Ваше на ТФЭ обращаю по причине того, что этот метод уже давно широко применяется «за бугром» и у него есть масса достоинств, в отличие от ЖЖЭ. Если брать патроны со смешанной фазой С18 или С8 и катионитом это позволяет провести фракционирование на вещества кислой, нейтральной и основной природы, кроме того, на данных патронах можно легко выделять вещества амфотерные, которые имеют в своей структуре группы кислотного и основного характера. В случае ЖЖЭ можно конечно определить точку рН, при которой происходит образование цвиттер-ионов, и провести экстракцию, но выход будет на прямую зависеть от липофильности вещества и его растворимости в экстрагенте. Вот как-то так.

Сообщение отредактировал KSS17 - 29.11.2009 - 09:19

[CHSV-45]

Здорово, конечно, все пообщались. А для чего? Для того, чтобы до периферии дошло лет через 10? Методики нужнее ЭКОНОМИЧНЫЕ , ДОСТУПНЫЕ не только для МО , СПБ, Тюменской области и т.д. У нас, я думаю, ещё долго будет использоваться кислотный гидролиз из-за его ДОСТУПНОСТИ. А про ферментный будем читать в Ваших работах. ТФЭ: тоже хорошо, но заказана,правда никак не оплачена из-за отсутствия средств в местном бюджете. Хорошо размышлять ЦЕНТРУ и ТЕОРЕТИКАМ. А тем, кому возможно и найдут средства на приобретение- потом не найдут на расходники. Потому- да здравствует ЖЖЭ и кислотный гидролиз! Я думаю малые города и городишки меня поймут.

[KSS17]

Здравствуйте!
А вот ферментный гидролиз пользовать налево и направо я бы не советовал...
Неоднозначные результаты он иногда выдаёт.
Кислотный гидролиз рулит...

Сообщение отредактировал KSS17 - 30.11.2009 - 20:12

[Провизор]

Уважаемых KSS17. Кислотный гидролиз хорош, но только для идентификации веществ. А как быть с количественной оценкой? Вас не смущает количественное определение по продуктам гидролиза? А ферментный гидролиз вы проводили с мочой, кровью или биоматериалом?
А ферменты я подбираю простые которые можно спокойно купить в аптечной сети и я думаю, что у глубинок проблем с этим не должно быть.

[KSS17]

Здравствуйте!
Ну не надо всё в одну кучу валить…
Сначала обычно бывает скрининг, и только потом количественное определение с применением специфичной методики. И причины этого две. Первое, скрининг не всегда оптимален для каждого аналита, это обычно компромисс. Второе, количественное определение, проводимое по отдельной методике, является ещё и подтверждающим методом.
В своём высказывании я имею ввиду исключительно 'бета'-глюкоуронидазу, прочие ферменты в нашей работе экзотика…

[Провизор]

Я все в одну кучу и не валю. Это понятно, что сначало идет обнаружение, которое вы (как я поняла) проводите после кислотного гидролиза (крови, мочи). А потом для количественного определения вы, изолируете каждый найденный компонент частными методами что-ли? Не проше ли сразу получить одно извлечение и дальше с ним работать по всем направлениям.
А на счет остальных ферментов вы не правы, они вполне доступны в аптечной сети и цена у них меньше, чем у глюкуронидазы.

[KSS17]

Здравствуйте!
Не проще…
Загрязнение пробы каким-либо веществом побредёт, как мы понимаем, везде…
При определении какого-либо вещества в объекте мы обязательно количественное или даже подтверждающее исследование проводим из отдельной пробы объекта.
Ждём Ваших наработок…