[MedGen]

Здравствуйте. Очень нужна помощь. Проблема в следующем: имеются гистологические срезы, заключенные между предметным и покровным стеклами. Нужно выделить из этих срезов ДНК с целью выявления точковых мутаций (ПЦР, секвенирование). Кто-нибудь сталкивался с такой задачей? Как можно сделать это с минимальными потерями биологического материала? можно ли как-то оптимизировать под это дело протокол фенол-хлороформной экстракции и как лучше всего отделить стекла друг от друга и сам срез от стекла?

Сообщение отредактировал MedGen - 30.07.2010 - 15:08

[savskaya2]

Здрасьте, здрасьте.
Сталкивались с этой задачей - исследования на корню задушили. Могу рассказать Вам про блоки - до стекол не дали мне дойти. Из блоков при обычной 48 - часовой формалиновой фиксации неплохо ДНК выделяется даже фенол-хлороформом и хорошие результаты дает ПЦР. Вопрос в том, сколько пролежало в формалине, в каком формалине и чем красили препараты на стеклах. В обычной гематоксилин-эозиновой окраске применяются сильные спирты и соляная кислота, так что многое зависит от того, какая окраска... Попробуйте найти блоки и взять кусочек в несколько кубических миллиметров. Стекла гистологические единственным способом друг от друга отделяют - погружают в раствор ксилола на неск. часов - и проверяют периодически растворился ли фиксатор (их несколько видов - природные и синтетический).

Сообщение отредактировал savskaya2 - 30.07.2010 - 21:29

[MedGen]

Да из блоков я выделяю фенолом, дело в том, что кроме стекол от пациента больше ничего нет.
спасибо за совет, попробую с ксилолом. стеклам около 4 лет.

[Зубр]

Да из блоков я выделяю фенолом, дело в том, что кроме стекол от пациента больше ничего нет.
спасибо за совет, попробую с ксилолом. стеклам около 4 лет.

Уважаемый 'MedGen'!
Ксилол может оказаться бессильным, для того чтобы снять фиксирующий покровное стекло материал. Был случай: тупо колол покровное стекло стерильным скальпелем, поддевал осколки тем же скальпелем. Препарат (99%) остаётся на предметном стекле. Тут другая проблема, даже не одна. 1. загрязнение человеческим материалом, вносимое при приготовлении срезов (характерно для России, где нет полного цикла автоматизации: от фрагмента ткани до готового стекла). 2. толщина среза играет роль, из какого/каких органов и тканей срез. 3.Некоторые виды гистологических окрасок катастрофически влияют на ДНК, можно даже не пытаться такие окрашенные препараты генотипировать. Какая окраска у Вас в руках? Как Вы собираетесь выделять ДНК - как блоки стандартно, с октаном? Если говорить об очистке ДНК из уже полученного лизата, то я сторонник фенола с хлороформом. Критика этого классического метода часто связана с продвижением на рынок биотехнологических услуг различных наборов для получения ДНК. В Вашем случае, так как ДНК будет заведомо мало, необходимо добавить в раствор перед преципитацией какой-нибудь соосадитель. В целом, стёкла, пожалуй, один из самых проблемных объектов для ДНК-анализа.
Успехов.

[MedGen]

Зубр, спасибо за советы. у меня, если честно, тоже была такая мысль - соскоблить покровное стекло вместе с образцом и выделять из толченого стекла))) какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек. про загрязнение образца побочным человеческим материалом - мне кажется, в нашем случае это очень вероятно хотя, если искать конкретную точковую мутацию, на сиквенсе она определяется, если она присутствует как минимум 20% ДНК-копий, если мне не изменяет мой склероз, конечно))))
будем пробовать разные варианты

[Зубр]

...какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек...

Уважаемый 'MedGen'!
Показав стёкла специалистам, можно определить и чем красили, и что красили. В крайности, можно хотя бы цветную фото внешнего вида (не под микроскопом) выложить с вопросом на ФСМ. Думаю, Вам помогут. Прикрепляю две статьи и ссылку по затронутой теме.
Успехов.
 histo_stain.rar ( 98.99 килобайт ) Кол-во скачиваний:  617

 Inf_st_pat.rar ( 124.11 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1216

 Inf_stains_DNA.rar ( 9.59 килобайт ) Кол-во скачиваний:  513

[MedGen]

Зубр, спасибо Вам большое!!!

[Lady]

Как Вы собираетесь выделять ДНК - как блоки стандартно, с октаном?

Можно узнать поподробнее что Вы имеете ввиду? Как получаете и очищаете лизат из блоков? Для чего нужен октан? Никогда с такой задачей ранее не сталкивалась, а, видимо, скоро предстоит.
Каким методом выделяете из фрагментов биоматериала, хранящихся в формалине?
Лучше ДНК получать из блоков или кусочков органов, извлеченных из гистологического формалинового архива (при условии, что они принадлежат одному лицу)?

[Зубр]

Доброго времени суток, уважаемая 'Lady'!

Можно узнать поподробнее что Вы имеете ввиду? Как получаете и очищаете лизат из блоков? Для чего нужен октан? Никогда с такой задачей ранее не сталкивалась, а, видимо, скоро предстоит...

На форуме уже были прикреплены материалы (и остаются доступными) по выделению ДНК из гистологических препаратов. Это было год или два назад, то есть, давно, поэтому Вам простительно, что не нашли их. В качестве примера прикрепляю ещё два файла по очистке ДНК.

...Каким методом выделяете из фрагментов биоматериала, хранящихся в формалине?...

Всё что погружено в формалин - очень быстро превращается в непригодный для ДНК анализа материал. Поэтому. чем меньше время экспозиции тканей в формалине, тем лучше. А выделять можно любым способом, какой Вам больше нравится.

...Лучше ДНК получать из блоков или кусочков органов, извлеченных из гистологического формалинового архива (при условии, что они принадлежат одному лицу)?

Лучше из блоков.
 Protocol_to_Extract_DNA_From_Paraffin_Blocks.pdf ( 74.06 килобайт ) Кол-во скачиваний:  765

 2441.4032_DNA_Prep_ParaffinTiss.pdf ( 89.51 килобайт ) Кол-во скачиваний:  783

[Наталья]

Всё что погружено в формалин - очень быстро превращается в непригодный для ДНК анализа материал.

Уважаемый Зубр! Если кусочки вырезают через 1-2, а то и 3 суток пребывания в формалине, они еще могут быть пригодны для ДНК анализа? А кусочки из сырого архива, хранящегося в баке с формалином в марлевом узелке среди десятков (сотен) таких же марлевых узелков от других трупов, уже непригодны, как я понимаю.

[Зубр]

Уважаемый Зубр! Если кусочки вырезают через 1-2, а то и 3 суток пребывания в формалине, они еще могут быть пригодны для ДНК анализа? А кусочки из сырого архива, хранящегося в баке с формалином в марлевом узелке среди десятков (сотен) таких же марлевых узелков от других трупов, уже непригодны, как я понимаю.

Да, уважаемая Наталья, почти что так. Деструкция ДНК в формалине приводит к невозможности применения тех методов, которыми она стандартно анализируется (не может работать ДНК-полимераза и др.ферменты). Поэтому, методические подходы к очистке ДНК из "формалинизированных" тканей сводятся к восстановлению структуры ДНК, в первую очередь.

[Unior]

Добрый, э-э-э, Здравствуйте!
Разрешите вставить и свои "пять копеек", одним словом, привет от гистологов!
Не знаю, известно ли вам сие, и как это может повлиять на ваши исследования, но думаю поделиться некоторыми секретами производства гистологических препаратов. Так вот, существует такое понятие, как "белкование стёкол", этим занимаются лаборанты и суть заключается в том, что берётся белок куриного яйца и наносится на предметное стекло с целью лучшего "прилипания" гистологического зреза. Выводы делайте сами. Существенно ли это для вас или нет, я не знаю, но информацию к размышлению дал.

[someone]

Куриная ДНК к счастью человеческими праймерами не берется.

[alex-lab]

Есть коммерческий набор, который разработан специально для выделения ДНК из фиксированных тканей

[Доктор Немо]

какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек.

Если Вам это важно - покажите стекла любому гистологу
Он сразу скажет, что это за орган и что это за окраска