[лось]

Да, в Норильской кости концентрация ДНК 0,803 нг/мкл.

Мне подсказали, что этот эффект изучался Ивановым П.Л. В журнале "Судебно-медицинская экспертиза" за 2000 год сент-окт.; 43(5): 32-7 есть статья на эту тему.
Но я что-то не смог её найти...

С уважением, rostandrei.

есть вероятность, что "гребенка" появляется при изменении (уменьшении, модификации) специфичности полимеразы при взаимодействии с каким-то фактором (вероятно белковым). Тогда она будет амплифицировать несовершенные дуплексы, особенно при сильно разбавленной матрице. Кроме того, можно обсудить эффект ДНК-связывающих белков, которые могут "обманывать" полимеразу, конструируя якобы подходящий субстрат. То, что этот фактор белок, подтверждается улучшением ситуации после обработки фенолом.

всем привет, кое-кому поклон

[rostandrei]

То, что этот фактор белок, подтверждается улучшением ситуации после обработки фенолом.

всем привет, кое-кому поклон

Здравствуйте уважаемые!
Действительно, после фенольного выделения такого эффекта не наблюдал ниразу. Может у кого есть другой опыт?

Есть ещё мнение (у зарубежных коллег) что это контаминация, но не извне, а "контаминация своей (из кости) деградированной ДНК".

С уважением, rostandrei

[Gordiz]

И в той , и в другой предложенной версии есть несостыковки. Возможно, ответ где-то посередине. Т.е., есть и деградация, но есть и контаминация. Причём, мне кажется, что это контаминация не аллельным леддером, а суммой разных генотипов сотрудников лаборатории (а может и не только сотрудников). На сверхмалых количествах полагаю это возможно. Как Вам такая версия?
По поводу аллельного леддера и контаминации, прикрепляю полезную статью.

Уважаемый Зубр!
Я бы все-таки настаивал на версии контаминации лэддером. Безусловно, возможна также контаминация другими ПЦР-продуктами, геномной ДНК, суммой генотипов сотрудников, но лэддер в любом случае явно присутствует. Например, на первой картинке, где эффект наиболее ярко выражен, в локусе FGA присутствуют аллели 42.2-51.2. Кроме как из лэддера им взяться больше неоткуда, если, конечно, в лаборатории не работает пара сотен африканских студентов. При этом как в коммерческом лэддере Identifiler, так и в "лэддер-эффекте" отсутствует аллель 49.2, хотя в природе он встречается. То же самое можно увидеть в других локусах.
Боюсь, что предположение о неком белковом агенте, вызывающем нематричную амплификацию аллельной лестницы также не может объяснить этот факт. Хотя было бы здорово, если бы такой белок существовал. Как просто было бы создавать лэддеры!

[Зубр]

Доброго времени суток, коллеги!
А не пробовал ли кто-то из Вас раститровать аллельный леддер, проамплифицировать и разогнать?
Всем привет.

[Gordiz]

Доброго времени суток, коллеги!
А не пробовал ли кто-то из Вас раститровать аллельный леддер, проамплифицировать и разогнать?
Всем привет.

Уважаемый Зубр!
Нам приходилось реамплифицировать лэддер для возобновления его запаса, когда он заканчивался раньше остальных реагентов набора. Реамплифицированный лэддер выглядит похуже, чем оригинальный, но тоже работает. Нужно только быть внимательным: увеличенный статтер первого аллеля программа может воспринять как первый пик локуса и нумерация аллелей может сместится. В прикрепленном файле протокол.

[Зубр]

Уважаемый коллега 'Gordiz'!

Уважаемый Зубр!
Нам приходилось реамплифицировать лэддер для возобновления его запаса, когда он заканчивался раньше остальных реагентов набора...

Спасибо. Жаль только, что сначала кончаются праймеры, потом буфер, а уж потом - леддер .
Удачи.

[Gordiz]

Спасибо. Жаль только, что сначала кончаются праймеры, потом буфер, а уж потом - леддер .

Уважаемый Зубр! Бывают наборы, в которых сначала кончается лэддер. Например, раньше в наборах Qiagen лэддера хватало на 10 нанесений.
Всех с Новым Годом!

[Razum72]

Добрый день ув. форумчане! Новый год прошел и тема затухла, я считаю необходимо её возобновить, т.к. в проблеме до конца так и не разобрались!
В моем, хоть и скромном, опыте уже не раз встречался подобный эффект, и всегда это был сложный объект (старая кость, очень гнилая кровь или ткань, грязные старые вещ.доки). Утверждать что это контаминация или белковое загрязнение утверждать не стану, т.к. имею мало практики по сравнению с большинством из Вас, но точно скажу что и при выделении фенолом, и при выделении сорбентом, наблюдал леддер эффект, при чем почти всегда он наблюдался не во всех локусах, а только в некоторых, в остальных типичная картина деградации ДНК.
Так что давайте думать и высказываться, может придем к единому предположению.

[Lady]

Коллеги, недавно выделяла ДНК фенолом из гнилостно измененных кусочков печени и сердца (брала 2 кусочка). Труп нашли в сточных водах. Ставила вертикальный форез, естественно ни один раз с перевыделением. Результат: в большинстве локусов пусто, в некоторых - по 4 четко выявляемых аллеля, совпадающих у органов в каждом локусе. Никто из сотрудников лаборатории не является обладателем подобных аллелей. Что это может быть? Деградация?

[Зубр]

Уважаемая 'Lady'!

Коллеги, недавно выделяла ДНК фенолом из гнилостно измененных кусочков печени и сердца (брала 2 кусочка). Труп нашли в сточных водах. Ставила вертикальный форез, естественно ни один раз с перевыделением. Результат: в большинстве локусов пусто, в некоторых - по 4 четко выявляемых аллеля, совпадающих у органов в каждом локусе. Никто из сотрудников лаборатории не является обладателем подобных аллелей. Что это может быть? Деградация?

Вряд ли кто-то возьмётся отвечать, не видя картинок. Выложите фото пластин, тогда можно о чём-то порассуждать. Хорошо бы и методики выделения и очистки в более подробном режиме узнать - это помогло бы разбираться.
Удачи.

[rostandrei]

Уважаемый Зубр!
Я бы все-таки настаивал на версии контаминации лэддером. Безусловно, возможна также контаминация другими ПЦР-продуктами, геномной ДНК, суммой генотипов сотрудников, но лэддер в любом случае явно присутствует. Например, на первой картинке, где эффект наиболее ярко выражен, в локусе FGA присутствуют аллели 42.2-51.2. Кроме как из лэддера им взяться больше неоткуда, если, конечно, в лаборатории не работает пара сотен африканских студентов. При этом как в коммерческом лэддере Identifiler, так и в "лэддер-эффекте" отсутствует аллель 49.2, хотя в природе он встречается. То же самое можно увидеть в других локусах.
Боюсь, что предположение о неком белковом агенте, вызывающем нематричную амплификацию аллельной лестницы также не может объяснить этот факт. Хотя было бы здорово, если бы такой белок существовал. Как просто было бы создавать лэддеры!

Здравствуйте уважаемые форумчане. Ситуация с нашим лэддер эффектом прояснилась (извините что отвечаю после большого перерыва). Поставили на ПЦР пустую пробу - с одним только BTA буфером, который использовался для выделения ДНК из костей. И он то и дал этот самый эффект! При более внимательном осмотре флакона, в котором он был получен, обнаружилась что крышка, как туго её не завинчивай, не обеспечивала герметичность. И тут я вспомнил что при вскрытии пакетика в котором содержался флакон, внутренности были влажными. Я посчитал это настолько невероятным, что решил что мне показалось... Оказалось что нет.

[smex]

Здравствуйте уважаемые форумчане. Ситуация с нашим лэддер эффектом прояснилась (извините что отвечаю после большого перерыва). Поставили на ПЦР пустую пробу - с одним только BTA буфером, который использовался для выделения ДНК из костей. И он то и дал этот самый эффект! При более внимательном осмотре флакона, в котором он был получен, обнаружилась что крышка, как туго её не завинчивай, не обеспечивала герметичность. И тут я вспомнил что при вскрытии пакетика в котором содержался флакон, внутренности были влажными. Я посчитал это настолько невероятным, что решил что мне показалось... Оказалось что нет.

Да, это, безусловно, самый надежный на сегодняшний СМЭ день способ изготовления лэддераа

[genosys]

Здравствуйте уважаемые форумчане. Ситуация с нашим лэддер эффектом прояснилась (извините что отвечаю после большого перерыва). Поставили на ПЦР пустую пробу - с одним только BTA буфером, который использовался для выделения ДНК из костей. И он то и дал этот самый эффект! При более внимательном осмотре флакона, в котором он был получен, обнаружилась что крышка, как туго её не завинчивай, не обеспечивала герметичность. И тут я вспомнил что при вскрытии пакетика в котором содержался флакон, внутренности были влажными. Я посчитал это настолько невероятным, что решил что мне показалось... Оказалось что нет.

По-идее, "пустая" изоляция ДНК с последующим ПЦРом и форезом в параллеле с испытуемым образцом должна всегда проводиться в кач-ве контроля контаминации. Если средства не позволяют делать это каждый раз, то хотя бы раз в неделю или с каждой новой партией реактивов - обязательно! Как бы азы...