[chemy]

У кого-нибудь была экспертиза по отравлению препаратом "Глюкофаж"? Не могу подобрать условия определения методом ВЭЖХ. Поделитесь, пожалуйста.

[Deminolog]

Хм... Если Вы выложите сюда хроматограмму, условия элюирования, параметры системы (температура термостата, какая колонка - сорбент, размер зернения, длина, толщина, скорость потока), наименование прибора (дабы знать, в каких пределах рабочих параметров мы зажаты. Милихром не даст нам играть с потоками, например, термостата нет у него... Там только подвижная фаза). то может смогу помочь, хотя бы исходя из классических представлений о ВЭЖХ. Ну и где примерно сидит аналит на хроматограмме Я так понимаю, речь идет о ВЭЖХ-УФ? Если да - то какая аналитическая длина волны была выбрана?

[chemy]

Хм... Если Вы выложите сюда хроматограмму, условия элюирования, параметры системы (температура термостата, какая колонка - сорбент, размер зернения, длина, толщина, скорость потока), наименование прибора (дабы знать, в каких пределах рабочих параметров мы зажаты. Милихром не даст нам играть с потоками, например, термостата нет у него... Там только подвижная фаза). то может смогу помочь, хотя бы исходя из классических представлений о ВЭЖХ. Ну и где примерно сидит аналит на хроматограмме Я так понимаю, речь идет о ВЭЖХ-УФ? Если да - то какая аналитическая длина волны была выбрана?

Прибор "Милихром А-02", работаю на длинах волн 210, 220,230, 240,250,260, 280 и 300 нм, пробовала два варианта элюентов 1).Элюент А 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент В -ацетонитрил, 2) метанол 100 %, поскольку у Clarka спектр метформила представлен в метаноле. Градиент элюента В от 2 до 100 % за 3000 мкл, скорость потока 150 мкл/мин., температура термостата колонки 35-40 град. Колонка 75х2 мм, фаза Prontosil 120-5C-18, зернение 5 мкм. Исходя из данных Clarka, максимум поглощения метформина в метаноле при длине волны 236 нм, то могу предположить, что на хроматограмме метформин выходит маленьким пиком (площадь пика 0,8 Auxмкл - и это раствор таблетки примерно 1/4 в 1 мл метанола)с временем удерживания 2,88 мин (спектр имеет максимум поглощения 234 нм). Снимала метанольный раствор метформина и раствор в 0,1 н р-ре солянки на спектрофотометре - спектра не вижу!

[Deminolog]

А хроматограмму? Судя по времени удерживания, компонент практически не удерживается... Что мешает определению, количество пиков, форму пика можно увидеть только по хроматограмме... Условия есть - уже хорошо... Хроматограмму в виде картинки сбросьте, пожалуйста... Мы ж не экстрасенсы, количество компонентов не видим

[chemy]

Да, если это действительно метформин, то практически не удерживается и очень низкая чувствительность, при хроматографировании в изократическом режиме, далее 2-х минут хроматограмка пустая.

[Deminolog]

Температуру понижайте до 30 градусов. Разброс в 5 градусов (35-40) не пойдет. Поверьте опыту, 5 градусов - это очень много. Если Вы не против, я бы хотел параллельно с ответом внести еще пару уточнений/рекомендаций:
1) Температуру советую понизить до 30. При этом контролируйте строго. Плюс-минус 5 градусов (35-40), это большая разница. При понижении температуры у Вас увеличиться время удерживания. Это обусловлено тем, что меняется вязкость Вашего элюента. Изменятся все времена удерживания, но я не думаю, что пик не будет разрешен. Сейчас же пик вполне разрешен. Вопрос только в том, что точно ли это аналит? Стандарт есть?
2) Линия через всю хроматограмму - это профиль градиента, как я понимаю? Но обратите внимание на то, что у Вас нет возврата к исходному элюенту. А это неправильно с точки зрения хроматографии. Поясню свои слова: в жидкостной хроматографии в каждый момент времени устанавливается динамическое равновесие. Поэтому для достижения максимальной воспроизводимости рекомендуется заканчивать программу всегда также, как она начинается. При этом регенерация - это где-то 2-3 объема колонки.
По самому градиенту: нет надобности уходить в очень сильный элюент, как я вижу. Т.е. все компоненты у Вас элюируются при 60% по объему сильного элюента. Кстати, здесь ацетонитрил или метанол? Вопрос принципиальный, поскольку у них разная элюирующая сила. Ацетонитрил сильнее намного, чем метанол. Кроме того, он более прозрачен в области 210 нм.
Изократика в каком по составу элюенте была? Два варианта - все могло просто вылететь не удерживаясь и все, если был сильный элюент, либо вышло только то, что не удерживается и все.

Значит еще один момент - Вы загрубили детектор или нет? Проверьте в настройках...

Итого: мой вариант для Вашей задачи, чтобы изменить картинку хроматограммы...
1) Программа элюирования: 90 буфера : 10 сильного элюента (метанол или ацетонитрил, что было по Вашей хроматограмме) 2 минуты. Потом за 2 минуты до 70:30, плато 3 минуты на ступени, потом за 5 минут идете к 30:70, плато на ступени 3 минуты, потом за 4-5 минут возвращаетесь на элюент первой ступени, плато на этом элюенте 4 минуты. Все параметры берутся с запасом, можно будет потом обрезать лишнее. Аналит искать на 2 ступени, ориентировочно... Но надежнее - по соотношениям спектральным.
2) температура - 30, либо 35 градусов (строго, без разброса в 5 градусов).
3) программу 2 раза запустить по программе в холостую, чтобы пришла в равновесие. Перед холостыми запусками на 4-5 минут на элюенте первой ступени пусть постоит для верности. Холостой запуск - вкол воды. Дистиллированной воды. Увидите заодно, нет ли артефактов каких...
4) как получите хроматограмму - дайте посмотреть
5) Колонке для установления температуры (она прогреться и внутри должна) дайте минут 15. Можете холостые погонять в это время, нормально будет.

Но если регенерации элюентом первой ступени нет - эта мягкая программа элюирования может и не помочь. Как сделаете - выложите картинку, пожалуйста, тогда будет намного проще искать ответ, если не получится эффективно разделить. Был бы препарат под рукой - сделал бы на своем хроматографе...
Были бы из одного города - с удовольствием бы помог лично, а не по форуму... Самому как-то проще все делать, чем через форум пытаться решать задачи)))

Сообщение отредактировал Deminolog - 18.05.2012 - 18:35

[chemy]

Температуру понижайте до 30 градусов. Разброс в 5 градусов (35-40) не пойдет. Поверьте опыту, 5 градусов - это очень много. Если Вы не против, я бы хотел параллельно с ответом внести еще пару уточнений/рекомендаций:
1) Температуру советую понизить до 30. При этом контролируйте строго. Плюс-минус 5 градусов (35-40), это большая разница. При понижении температуры у Вас увеличиться время удерживания. Это обусловлено тем, что меняется вязкость Вашего элюента. Изменятся все времена удерживания, но я не думаю, что пик не будет разрешен. Сейчас же пик вполне разрешен. Вопрос только в том, что точно ли это аналит? Стандарт есть?
2) Линия через всю хроматограмму - это профиль градиента, как я понимаю? Но обратите внимание на то, что у Вас нет возврата к исходному элюенту. А это неправильно с точки зрения хроматографии. Поясню свои слова: в жидкостной хроматографии в каждый момент времени устанавливается динамическое равновесие. Поэтому для достижения максимальной воспроизводимости рекомендуется заканчивать программу всегда также, как она начинается. При этом регенерация - это где-то 2-3 объема колонки.
По самому градиенту: нет надобности уходить в очень сильный элюент, как я вижу. Т.е. все компоненты у Вас элюируются при 60% по объему сильного элюента. Кстати, здесь ацетонитрил или метанол? Вопрос принципиальный, поскольку у них разная элюирующая сила. Ацетонитрил сильнее намного, чем метанол. Кроме того, он более прозрачен в области 210 нм.
Изократика в каком по составу элюенте была? Два варианта - все могло просто вылететь не удерживаясь и все, если был сильный элюент, либо вышло только то, что не удерживается и все.

Значит еще один момент - Вы загрубили детектор или нет? Проверьте в настройках...

Итого: мой вариант для Вашей задачи, чтобы изменить картинку хроматограммы...
1) Программа элюирования: 90 буфера : 10 сильного элюента (метанол или ацетонитрил, что было по Вашей хроматограмме) 2 минуты. Потом за 2 минуты до 70:30, плато 3 минуты на ступени, потом за 5 минут идете к 30:70, плато на ступени 3 минуты, потом за 4-5 минут возвращаетесь на элюент первой ступени, плато на этом элюенте 4 минуты. Все параметры берутся с запасом, можно будет потом обрезать лишнее. Аналит искать на 2 ступени, ориентировочно... Но надежнее - по соотношениям спектральным.
2) температура - 30, либо 35 градусов (строго, без разброса в 5 градусов).
3) программу 2 раза запустить по программе в холостую, чтобы пришла в равновесие. Перед холостыми запусками на 4-5 минут на элюенте первой ступени пусть постоит для верности. Холостой запуск - вкол воды. Дистиллированной воды. Увидите заодно, нет ли артефактов каких...
4) как получите хроматограмму - дайте посмотреть
5) Колонке для установления температуры (она прогреться и внутри должна) дайте минут 15. Можете холостые погонять в это время, нормально будет.

Но если регенерации элюентом первой ступени нет - эта мягкая программа элюирования может и не помочь. Как сделаете - выложите картинку, пожалуйста, тогда будет намного проще искать ответ, если не получится эффективно разделить. Был бы препарат под рукой - сделал бы на своем хроматографе...
Были бы из одного города - с удовольствием бы помог лично, а не по форуму... Самому как-то проще все делать, чем через форум пытаться решать задачи)))

Температура у меня держится стабильно, написала 35-40 град не корректно, я пробовала при 40 и 35 град, поскольку для некоторых препаратов при увеличении температуры колонки до 40 град увеличивается чувствительность, но попробую понизить, даже может быть попробую при комнатной температуре. Естественно, раз работаю в градиентном режиме, то есть регенерация между анализами, т.е. перед каждым анализом возвращаяюсь в исходную точку анализа. При изменении градиента от 2 до 100%, от 2 до 50 % что при использовании ацетонитрила, что метанола время выхода этого пика меняется незначительно примерно 2,3 - 2,8 мин. И еще это хроматограмма препарата "Глюкофаж", растворенного в воде (по Clarky метформил лучше всего растворяется в воде). Спасибо за совет, попробую, но уже только в понедельник.

[Deminolog]

Так это ж существенно меняет дело Вы прям обрадовали Тогда внесу поправку в свое сообщение: не 90:10 начинайте, а 95:5, плато, потом резко переходите на 70:30. Пусть сначала выйдут компоненты, которые не удерживаются на колонке. А потом за счет достаточно высокой элюирующей силы выскакивает аналит. У Вас хорошо разделились компоненты, если это Вы уверены, что на 2.71 - Ваш аналит. Просто он вышел на хвосте остальных пиков, а эта ступень должна избавить Вас от хвоста, тогда, соответственно, несколько вырастет и сам сигнал, базовая-то ниже станет.
До комнатной - не надо. Пик размажет. 30 либо 35. 0,5 минуты довольно солидная разница. Просто добавьте ступень градиента... Если результат понравится - увеличивайте скорость потока, если это реально, пик станет уже, просто поправите градиент в соответствии со скоростью потока. Увеличите скорость анализа