[genetics]

Добрый день!
Оговорюсь сразу, темы про выделение ДНК из фиксированных препаратов прочитала.
На экспертизу пришел абортивный материал в пластиковой таре (в контейнере для анализов), хранилось, судя по всему, не при +4. Запах не спирта, не формалина... а какой-то резины. В этой жиже коричнево-красной плавают, судя по всему, остатки эмбриона. По крайней мере, так написано в пояснительной надписи и постановлении. Сами по себе эти остатки не имеют никакой эластичности. При промывке все это еще много раз расслаивается. Из чего делается вывод, что это не фиксированный препарат...
Ставила на выделение уже и протоколом BTA для "деградированных объектов". Толку - 0,003 нг/мкл.
Коллеги, прошу совета. Что с этим делать? Как выделять?

[Razum72]

Добрый день!
Оговорюсь сразу, темы про выделение ДНК из фиксированных препаратов прочитала.
На экспертизу пришел абортивный материал в пластиковой таре (в контейнере для анализов), хранилось, судя по всему, не при +4. Запах не спирта, не формалина... а какой-то резины. В этой жиже коричнево-красной плавают, судя по всему, остатки эмбриона. По крайней мере, так написано в пояснительной надписи и постановлении. Сами по себе эти остатки не имеют никакой эластичности. При промывке все это еще много раз расслаивается. Из чего делается вывод, что это не фиксированный препарат...
Ставила на выделение уже и протоколом BTA для "деградированных объектов". Толку - 0,003 нг/мкл.
Коллеги, прошу совета. Что с этим делать? Как выделять?

Добрый день, уважаемые коллеги!
genetics, по вашему описанию мало что понятно, IPCCt сколько? У Вас либо ингибиция, либо не то или не так лизируете, либо сильная дегрдация, попробуйте сконцентрировать и поставить, посмотрите что получится.
Я обычно абортивный материал хорошо промываю, раскладываю на марлю, высушиваю, выделяю из нескольких участков - ВТА на ночь с ДТТ. Недавно выделял такой материал с характерным гнилостным запахом, стоял в холодильнике несколько недель, все прекрасно получилось. Удачи и Вам.

[genetics]

Спасибо за скорый ответ!
Ингибиции нет, в том-то и дело. С CtIPC все норм (28).
Мне не совсем понятен раствор, в котором предоставлен материал... Что это может быть? Если все разлагается...
В чем Вы промывали? В спирте и воде? Потом подсушивали, измельчали (сколько мг навески брали?) и лизировали, насколько я поняла. К ВТА добавляли DTT, а протеиназу не добавляли? Сколько ВТА, DTT и протеиназы? Ставили на 56 градусов на термошейкер? rpm сколько выставляли? По протоколу написано 1100. И оставляли на ночь. Потом выделяли, концентрировали. Я правильно поняла алгоритм?

[Razum72]

Спасибо за скорый ответ!
Ингибиции нет, в том-то и дело. С CtIPC все норм (28).
Мне не совсем понятен раствор, в котором предоставлен материал... Что это может быть? Если все разлагается...
В чем Вы промывали? В спирте и воде? Потом подсушивали, измельчали (сколько мг навески брали?) и лизировали, насколько я поняла. К ВТА добавляли DTT, а протеиназу не добавляли? Сколько ВТА, DTT и протеиназы? Ставили на 56 градусов на термошейкер? rpm сколько выставляли? По протоколу написано 1100. И оставляли на ночь. Потом выделяли, концентрировали. Я правильно поняла алгоритм?

Добрый день!
По поводу раствора трудно комментировать, могли плеснуть все что угодно, что под руку попалось - антисептик, например. Этот вопрос, а также процесс изъятия, хранения и транспортировки материала, необходимо выяснить у следователя, это очень поможет Вам разъяснить причину таких результатов. Нам обычно доставляют абортивный материал в нативном или замороженном виде. Возможно, Ваш материал просто гнил в анаэробной среде. Промываю деионизированной водой, затем 70% этанолом, затем опять водой, раскладываю на марлю и высушиваю. Тщательно рассматриваю материал, интуитивно выбираю наиболее подходящие участки и отрываю их от марли. Навески не взвешиваю, беру "на глаз", примерно 3х3 мм, измельчить можно, но я этого избегаю, как лишний повод контаминировать объект. 480 ВТА + 15 ПК + 7 ДТТ на 56 градусов на 18 часов, можно на термошейкер, у нас его нет, 1100 нормальные обороты, но это, в данном случае, не принципиальный момент (если к этому времени материал не лизировался полностью, можно добавить еще столько же ПК и на 2 часа 56 градусов). Затем лизат через фильтр-колонку при 14000 об/мин и на автомат на 1 программу. Обычно ДНК "выше крыши" и все прекрасно получается, редко когда в препарате ДНК только матери. Если у Вас изначально деградированный материал, тогда можно попробовать взять побольше материала, ДНК препарат почистить на Амиконе-4, сконцентрировать на Амиконе-0,5, поставить идентифайлер плюс с минифайлером или глобал, и уже по результатам высказываться о том, что материал не пригоден.
Удачи Вам!

[genetics]

Добрый день!
По поводу раствора трудно комментировать, могли плеснуть все что угодно, что под руку попалось - антисептик, например. Этот вопрос, а также процесс изъятия, хранения и транспортировки материала, необходимо выяснить у следователя, это очень поможет Вам разъяснить причину таких результатов. Нам обычно доставляют абортивный материал в нативном или замороженном виде. Возможно, Ваш материал просто гнил в анаэробной среде. Промываю деионизированной водой, затем 70% этанолом, затем опять водой, раскладываю на марлю и высушиваю. Тщательно рассматриваю материал, интуитивно выбираю наиболее подходящие участки и отрываю их от марли. Навески не взвешиваю, беру "на глаз", примерно 3х3 мм, измельчить можно, но я этого избегаю, как лишний повод контаминировать объект. 480 ВТА + 15 ПК + 7 ДТТ на 56 градусов на 18 часов, можно на термошейкер, у нас его нет, 1100 нормальные обороты, но это, в данном случае, не принципиальный момент (если к этому времени материал не лизировался полностью, можно добавить еще столько же ПК и на 2 часа 56 градусов). Затем лизат через фильтр-колонку при 14000 об/мин и на автомат на 1 программу. Обычно ДНК "выше крыши" и все прекрасно получается, редко когда в препарате ДНК только матери. Если у Вас изначально деградированный материал, тогда можно попробовать взять побольше материала, ДНК препарат почистить на Амиконе-4, сконцентрировать на Амиконе-0,5, поставить идентифайлер плюс с минифайлером или глобал, и уже по результатам высказываться о том, что материал не пригоден.
Удачи Вам!

Вам спасибо большое за подробный ответ. В принципе так и сделала. Поставила в итоге минифайлером. Вот понедельника с надеждой жду - чтобы результаты фореза посмотреть.