[Deminolog]

Слишком сложно. Прежде всего надо отстроить MRM, для этого нужно вещество, чтобы установить переходы, потом поставить метод - сделать ряд бланков, посмотреть матричные эффекты и т.д., а потом уж и анализировать. Если надо ловить метаболиты - то там уже напуск вещества в источник невозможен, отстраивать придется последовательными вколами... Если делать по совести, по всем критериям валидации - это не так уж и быстро. Прописать ряд процедур можно и нужно, но точно также их надо прописывать и на ГХ-МС.
Точные массы я бы и не стал делать. Либо MRM, либо МСВР. Иначе перегружаете схему. Конечно, МСВР удобен тем, что есть возможность ретроспективы, которой нет у низкого разрешения, но содержать в каждой лаборатории такой парк - это лишнее...

[alexlp]

По просьбе нашего коллеги Сергея Александровича Савчука публикую обращение оргкомитета II-й ЕЖЕГОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «Создание единой системы межведомственного взаимодействия экспертных лабораторий правоохранительных органов, химико-токсикологических лабораторий и лабораторий бюро СМЭ в сфере выявления новых наркотических средств» к авторам обсуждаемой методики и ФЕДЛАБ:

Добрый день, уважаемые коллеги!

Большое спасибо Ассоциации специалистов и организаций лабораторной службы «ФЕДЕРАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ МЕДИЦИНЫ»
за возможность обсуждения проекта методики:
"Диагностика потребления наркотических средств, психотропных и других токсических веществ методами иммунохроматографического анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии"

По заявленным критериям предложенная методика несомненно является актуальной и инновационной, выполненной с применением наиболее современного аналитического оборудования.Методика сочетает методы предварительного и подтверждающего исследования, которые обеспечивают идентификацию широкого набора веществ (более 4000 тыс.соединений) с высочайшей чувствительностью. Несомненно, авторам удалось существенно превзойти имеющиеся мировые аналоги. Однако, работа на таком уровне селективности, специфичности и чувствительности накладывает огромную ответственность на специалиста, работающего в этом методе. Поскольку,методик такого уровня пока нет даже в спортивном тестировании, возникают вопросы, на которые хотелось бы получить ответы:

Не приведет ли гиперчувствительность метода к гипердиагностике?
Способен ли метод предварительного анализа определить 4308 веществ, заявленных в методике?
Поскольку тройной квадруполь с линейной ионной ловушкой выпускает только одна фирма, имеют ли авторы вариант методики для трехквадрупольного детектора без опции ионной ловушки? Удалось ли авторам настроить ионную ловушку для всех 4308 соединений сразу. Раньше для каждой группы веществ требовался отдельный оптимизированный метод.
По сложившейся практике на трехквадрупольных приборах можно было определять не более 450 веществ в один цикл анализа. Сколько циклов анализа требуется для идентификации заявленных 4308 соединений и как это коррелирует с возможностью анализа 400 проб в день? Если каждую пробу анализировать несколько раз для полной идентификации, сколько проб можно проанализировать?
Есть также ряд других вопросов. Исходя из этого хотел бы предложить следующее.

26-27 мая 2016 года в Институте фармации Первого МГМУ им. Сеченова будет проводиться
II-я ЕЖЕГОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

«Создание единой системы межведомственного взаимодействия экспертных лабораторий правоохранительных органов, химико-токсикологических лабораторий и лабораторий бюро СМЭ в сфере выявления новых наркотических средств»



Конференция подана для внесения в план мероприятий Минздрава. В рамках этой конференции оргкомитет планирует провести круглый стол на тему

Обсуждение новых методик химико-токсикологического анализа и практических аспектов применения Приказов МЗ РФ № 230 и 933н по медицинскому освидетельствованию на состояние опьянения

Оргкомитет конференции будет просить глубокоуважаемого Бориса Николаевича Изотова возглавить круглый стол и тщательно обсудить предложенную методику.

Мы также будем просить Александра Евгеньевича Носырева и Юрия Евгеньевича Кочнева провести мастер- классы по новым методам предварительного и подтверждающего анализа. Оргкомитет конференции готов предоставить коллекцию биологических жидкостей, исследования которых были проведены в 20-ти лабораториях в рамках многоцентровых испытаний, а также новое масс-спектрометрическое и хроматографическое оборудование различных производителей. Приборы оснащены трехквадрупольными детекторами, трехмерными ионными ловушками и масс-спектрометрами высокого разрешения. Имеющееся в наших лабораториях оборудование может, по желанию авторов методики, быть использовано для адаптации методики на различном масс-спектрометрическом оборудовании.

От оргкомитета конференции, с уважением

Савчук Сергей Александрович, д.х.н.

[alexlp]

Однако больше всего меня интересует, откуда информация о том, что 4000+ соединений можно прогнать за раз? Скажем так, более 300 соединений в один скрининг - это заведомо обреченный на провал эксперимент. И здесь проблема, в первую очередь, железа, которое не переварит такое дикое количество MRM-переходов, да еще и надо обеспечить достойное хроматографическое определение. Здесь очень объемный пункт, о котором можно писать очень много и долго, этому, пожалуй, посвящу отдельный пост в теме про LC-MS/MS, постараюсь сопроводить его также и иллюстрациями.

На самом деле - все достаточно скромнее. 4300 соединений - это красивая и не реальная цифра, которая ничем не подтверждена. Авторы дают ссылку на некий сайт, где размещена эта библиотека, но сайт не функционирует.
В тексте методики, в приложении 2, приведен список из 600 соединений, причем не самых актуальных, которые могут быть обнаружены этим методом.
Не впечатляет, потому, что даже Сайкс предлагает из коробки решение на 1250 наркотических или других запрещенных и связанных с ними препаратов с максимум 6 переходами на вещество. MRM каталог может быть использован для создания дополнительных количественных и/или скрининговых методов. В режиме положительной ионизации анализируется 700 аналитов.
Брюкер предлагает из коробки Unique and comprehensive library of over 830 compounds based on retention time, MS, MS2 and MS3 ion trap spectra.
Как я понимаю, для того, чтобы обеспечить такую удвоенную плотность используется "информационно-зависимый, селективный sМRM анализ, при котором учитывается время выхода вещества из колонки хроматографа". Т.е. тригерная регистрация полного спектра продуктов. Но это жесткая привязка к времени удерживания. Соответственно вопрос: как калибровать систему по временам?

И еще нюанс: пробоподготовка не предполагает какой либо гидролиз, а тема метаболитов II фазы в манускрипте явно не раскрыта...

Сообщение отредактировал alexlp - 28.04.2016 - 07:02

[Deminolog]

Добрый день!

Приятно видеть, что вопросы у нас примерно одинаковые...

Теперь, если Вы позволите, попробую ответить на кое-какие вопросы уважаемого Сергея Александровича, или, хотя бы, предположить возможные ответы...
Настроить ЛИЛ на все эти соединения просто нереально. Опять-таки, мы упираемся в несколько факторов - количество переходов, которые можно задать, а также подбор условий, при которых их можно надежно детектировать. При этом реально фантастической разницы с трипл-квадом ЛИЛ не даст.

Ну, насчет допинг-контроля - позволю себе не согласиться... :-) То, что я видел последний раз меня и поразило, и ужаснуло. Если ВАДА требует минимальный надежный порог 1 нг/мл по большинству соединений (наркотики, в частности, поголовно), то чтобы это выдать, надо на порядок ниже видеть. И это проблема. Приборы класса Sciex 3200, Shimadzu 8030, Thermo Access Max способны дать 0.1 нг/мл, но с огромным трудом. Другое дело, что допинг-контроль разносит процедуры по классам, что логично. Они имеют эту возможность. Токсиколог же не будет делать разные процедуры на НС, ПВ, кортикостероиды, диуретики и т.д.. Смысла-то особо и не будет тогда, как мне кажется. Нужно что-то более общее.

Гиперчувствительностью назвать возможности 3200 - не могу. Вот 6500 и 5500 - да, вот там просто кошмар, если хотите определять женский тестостерон без каких-либо манипуляций дополнительных - это к ним. Также, как и к Thermo Quantiva. Но принцип, предложенный в методике мне не нравится. Нет подтверждающих переходов, слишком много ложноположительных будет именно потому, что нет критериев и возможности их отсеять в том варианте, который предлагается сейчас.

Уважаемый коллега alexp, то, что предлагает и Сайкс, и Брукер из коробки - имеет жесткую привязку к конкретным условиям. Пользователи Токстайпера видят, что они получают жестко регламентированный комплект, включая колонку. Мое отношение к этому Вы знаете, но одно дело, когда я бухтеть могу, потому что у меня нет вала проб на рутине, а другое - когда надо гнать поток. Для потока - нет проблем. Но! 6 переходов - это избыточно, при наличии коэлюирующихся соединений, время сканирования каждого перехода падает, катастрофически падает и чувствительность.
Далее, по своему механизму классическая ИЛ не может работать в режиме MRM. Брукер предлагает сканирование full-MS2 и MS3 спектров, их сопоставление с библиотечными и по совокупности данных - идентификация. Плюсы - больше спектральных данных, надежнее результат. Минусы - получение каждого следующего поколения ионов приводит к потере чувствительности в 2-10 раз в среднем. Именно поэтому Брукеровская ловушка не позиционируется, как конкурент QqQ. Задачи у неё другие.
Калибровка системы по временам осуществляется с помощью тестового микса. Ставят колонку, стандартный метод, а потом подгоняют времена путем изменения даже длины капилляров, соединяющих МС и хроматограф.

Вот именно потому, что данная методика, предлагаемая уважаемой кафедрой, не является чем-то реально сверхестественным и может быть реализована на аналогичных системах компаний Аджилент, Шимадзу, Термо, Брукер (у них тоже есть QqQ, если что), и подавно может быть реализована на системах высокого разрешения, причем даже без МС/МС в ряде случаев (тупо в full scan TOF дает интересные результаты именно благодаря разрешению), жестко зажимать все на одного производителя - не стоит. Достаточно обеспечить лаборатории стандартными образцами, чтобы они могли проводить калибровки своих систем.

Относительно метаболитов II фазы - либо по конъюгатам работать (это возможно, но опять-таки, стандарты), либо вводить стадию гидролиза с глюкуронидазой. Кислотный гидролиз тоже работает, но есть риск сжечь и ряд аналитов, да и нейтрализовать кислоту надо после него.

Сообщение отредактировал Deminolog - 28.04.2016 - 10:41

[Chimik]

Добрый день! Прописали нам в "Порядке.." иметь ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией, а где деньги взять регионам?!! Подал КП по Toxtyper посмотрел гл.вр. на цифру в 40 млн и обратно отдала листок Но более острый вопрос по ik. Врет этот приборчик, а ЦХТЛ нас убеждает в обратном. Вот уже месяц выдает ложноположительные результаты по амфетамину, до этого подобная история была с MDMA.

[Korvet]

м-да....о том как врет этот ik с его полосками уже новостей полным-полно. Мне тут видео показывали как он 3 раза на одну и туже полоску разный результат выдавал...Вообще в чем был смысл "недопустимости визуальной фиксации предварительных тестов", ну кроме бизнеса конечно? чем это обосновано было? результат все равно предварительный. Зачем его через прибор гонять? Цифра концентрации? Ну бред же, все равно, плюс-минус километр все это....

[alexlp]

м-да....о том как врет этот ik с его полосками уже новостей полным-полно. Мне тут видео показывали как он 3 раза на одну и туже полоску разный результат выдавал....

Вы имеете в виду три раза с одной полоски считывались разные цифры? Я думаю - не удивительно.

[Korvet]

Вы имеете в виду три раза с одной полоски считывались разные цифры? Я думаю - не удивительно.

нет, там сначала был амфетамин, потом опий, потом он вообще сказал что нету....со слов того кто мне об этом рассказывал, производитель прокомментировал это тем что бракованная туба попалась...

[NVSh]

Вообще в чем был смысл "недопустимости визуальной фиксации предварительных тестов", ну кроме бизнеса конечно? чем это обосновано было? результат все равно предварительный. Зачем его через прибор гонять? Цифра концентрации? Ну бред же, все равно, плюс-минус километр все это....

Здравствуйте, во избежание скрывания в силу разных причин этой информации (хотя кому надо, скумекает) и не верной интерпретации результата

Сообщение отредактировал NVSh - 29.04.2016 - 07:59

[sch1sm]

Я свой опыт делал так лф развел в спирте и далее добавил в мочу в 50 100 500 нг.мл фенобарбитала в чистой моче. Далее мною были взяты моча от подследственных наркоконтроля с апвп и по площади пика на хроматограмме там концетрация около 500 нг мл. И ибупрофеновую 100 нг мл мочу и просто чистую мочу. Так вот в партии которая у меня была на ибупрофен давала постоянно ложноположительные результаты на опиаты и метмфетамин 10 полосок из 10, фенобарбитал работал от500 нг мл , из 10 полосок сработало 5 на 100 нгмл, а 50 нгмл 1 только полоска. , апвп не работал вообще, из мочи реанимационной на апвп ни одна не сработала из 10. Самое интересное что бланковая моча дала один раз на кокаин ложно положительную реакцию и бенздиазепины. Это безусловно не условная модель и нельзя сказать о правильности эксперемента, тк я не знаю как хранились полоски пока их до лаборатории везли , выборка нерепрезентабельна, мат обработки не было, это как раз просто домашний эксперемент. Но знаете лучину сомнения это во мне зажгло...

Сообщение отредактировал sch1sm - 29.04.2016 - 08:47

[sch1sm]

И самое главное что меня больше всего злит в том же приаазе 344 это отсутсвие внезапности. Люди заранее знают когда сдают и просто могут не употреблять некоторое время. А по вжхмсмс получается мне свой трипл не впихнуть никак в рамки которые прописаны в приборе Носарева, а никто из МЗ не будет разбираться почему, тк это никому не нужно, сказали такой вот порядок вот и извольте исполнить

Сообщение отредактировал sch1sm - 29.04.2016 - 08:48

[Deminolog]

Трипл практически любой пройдет по тем рамкам, которые в методике. 3200 - это далеко не новая машина, его чувствительность сопоставима с Thermo Access Max, Shimadzu 8030 и др.. Так что реализовать можно, тут проблема в том, что до типа масс-анализатора не будут ли докапываться и т.д..

[Korvet]

конечно будут, для чего вся эта песня и затевается. Вопрос только времени и как именно это они реализуют.

[sch1sm]

конечно будут, для чего вся эта песня и затевается. Вопрос только времени и как именно это они реализуют.

конечно, вот пример из жизни, сегодня звонит фирма и спрашивает почему мы до сих пор сдт не покупаем, я им в ответ, что ваш прибор завышен по цене и не обязателен для хтл, далее разговор пошел в сторону угроз, типа вы должны его иметь по 344 приказу и он же прописан в нормативах оказания нарко помощи. короче тупо принуждают покупать определенный прибор. хотя я нашел и более дешевые аналоги за границей, правда нет регистрации у нас в РФ.

[Deminolog]

С регистрацией все очень интересно, на самом деле. Я до сих пор не услышал (и, полагаю, не услышу) на каком основании вообще Минздрав ограничивает применение оборудования, не входящий в их собственный перечень. Если в Госреестре железо есть - все, какие вопросы? Есть федеральный закон "О единстве средств измерений", есть их реестр. Применение приборов в области здравоохранения прописано в самом ФЗ. На каком основании мнение отдельно взятого министерства стало важнее, чем федеральный закон - для меня загадка.