[STEEL]

Уважаемые коллеги, требуется ваша помощь. Подскажите кто как изолирует ксенобиотики из крови и из других б/ж прямой экстракцией?

Уважаемые коллеги, требуется ваша помощь. Подскажите кто как изолирует ксенобиотики из крови и из других б/ж прямой экстракцией?

Или где об этом почитать можно?

[chemist-sib]

Добрый день, коллега! Задавая столь общий вопрос, вы ожидаете получить какой-то конкретный ответ? Или, все таки, у вас имеется некая конкретная проблема, с конкретной матрицей (кровь и моча - две большие разницы. А если еще разведенную детскую молочную смесь пришлют, что сейчас очень полюбили нашим СОСУСКам…), конкретными аналитами, конкретным приборным оснащением (подготовка проб для ТСХ, СФМ, ВЭЖХ или ГХМС - может быть принципиально разной), под разные задачи (скрининг, количественное определение, дополнительное подтверждение...)?

[STEEL]

Добрый день, коллега! Задавая столь общий вопрос, вы ожидаете получить какой-то конкретный ответ? Или, все таки, у вас имеется некая конкретная проблема, с конкретной матрицей (кровь и моча - две большие разницы. А если еще разведенную детскую молочную смесь пришлют, что сейчас очень полюбили нашим СОСУСКам…), конкретными аналитами, конкретным приборным оснащением (подготовка проб для ТСХ, СФМ, ВЭЖХ или ГХМС - может быть принципиально разной), под разные задачи (скрининг, количественное определение, дополнительное подтверждение...)?

Здравствуйте) Ваши вопросы справедливы. Уточняю, имеется трупная кровь в объёме 5-10 мл. Исследовать экстракты вынужден методом ТСХ на широкий спектр веществ, но так как экстракта получится ничтожное количество, то исследовать буду исходя из своей статистики и МЗ № 1021. Так вот, необходимо провести экстракцию искомых аналитов из крови, например: барбитураты, производные 1,4-бензодиазепина, алкалоиды опия, производные фениалкиламина, производные пиразолона.

[chemist-sib]

Теперь уже все понятно: стандартная задача - "впихнуть невпихуемое"... - поскольку: на многое, из немного, разом, быстро и чисто. Увы, но общего и универсального решения этой задачи я не знаю. Попробую пояснить - почему. Ну, разделить перечисленные вами группы токсикантов, меняя рН среды - дело понятное: барбитураты - из кислого, оснОвные - из щелочного. Но, скажем, большинство нативных 1,4-бензодиазепинов будут хорошо извлекаться из щелочной водной фазы, а вот седуксен - влегкую пойдет уже из кислой; бОльшая часть производных пиразолона - вещества оснОвного характера, но среди них "затесался" бутадион - "перебезчик" - с кислотными свойствами; барбитураты, в принципе, неплохо извлекаются и из нейтральных, и даже из щелочных водных растворов. Хлороформ из кислой фазы может "вытащить" часть оснОвных веществ (те же самые кстантиновые алкалоиды), эфир из кислой фазы извлечет только барбитураты (ну, и седуксен); для опиатов очень желательно повысить полярность экстрагента (хлороформ + высшие спирты) и не переборщить со щелочью; для фенилалкиламинов - и одного хлороформа хватит, но щелочи нужно поболее. ТСХ, хоть и имеет - по всем нашим указивкам - статус предварительного, с судебно-отрицательным значением, но чувствительность его, во многих случаях, не самая высокая. А концентрация многих токсикантов в крови, наоборот, одна из самых низких - по сравнению с другими возможноыми биообъектами. Особенно это касается опиатов: исключать их в крови по ТСХ - "исследование с гарантированным отрицательным результатом!". Да и с современными психостимуляторами, приблизительно, такая же картина. Барбитураты, анальгин - вот это - пожалуйста! Проявление пластинок - это еще одна "болевая точка": чтобы как-то дифференцировать вещества - нужно, по-хорошему, несколько проявителей. Особенно это касается веществ оснОвного характера (а их среди наших токсикантов - процентов 80, если не больше). Не так много проявителей можно применять последовательно, наслаивая один на другой. У нас "в ходу" только один такой набор: под УФ (но-шпа, курантил, хинин), раствор хлорида железа (III) (группа пиразолона), реактив Драгнедорфа (почти все оснОвные вещества, с третичным и четвертичным азотом), раствор серной кислоты (ксантиновые алкалоиды). Но уже на банальный эфедрин (с его вторичным азотом) реактива Драгендорфа - маловато. Нужен нингидрин. На новые психостимуляторы и этого может оказаться маловато... И еще одна "болевая точка" вопроса - сколько надо наслоить в точку, чтобы по отрицательному результату ТСХ можно было с чистой совестью исключить что-то. Можно, конечно, как говорил у нас один товарищ: "Разбавить побольше, да - по капелькам, по капелькам...". Но вменяемые химики (ИМХО такое!) должны получать отрицательные результаты как-то по-другому... В некоторых методиках прописана аликвота биоматериала, соответствующая этой точке. Для тех же барбитуратов - по методписьму 1974 года - это 4 г (мл). Для опиатов (правда - для мочи и желчи), по методике (Барсегян со товарищи, 2010 г.) это - 2 мл, по одной из статей москвичей в СМЭ - уже 0,3 мл. Мы придерживаемся в общем случае аликвоты, соответствующей 5 г (ил) биоматериала. А ведь желательно еще и подтвердить свой предварительный результат...
Все, "Шахрезада заканчивает дозволенные речи"... До следующего раза (или - до новых вопросов после "подумать").
Пока время появилось - еще несколько мыслей изложу буковками. Пока выше я говорил о нативных веществах, и в свободной форме. В слысле - без предварительного гидролиза. Но собирание множества "осколков" в единый маркер (я - про "наши родные" бензодиазепины и их бензофеноны), а также расщепление водорастворимых связанных форм токсикантов (глюкурониды и сульфаты алкалоидов опия) - это тоже реальный и действенный способ повысить чувствительность всего исследования. Причем, гидролиз может быть и кислотный, и ферментативный. В последние лет 10-15 появилось достаточно много работ (вполне возможно - диссертационных; я специально не отслеживал) по предварительному гидролизу биожидкостей смесью различных ферментов, приводящую к повышению выхода при изолировании и уменьшению предела обнаружения целого ряда веществ оснОвного характера. А если все это сочетнуть с грамотным изменением рН и правильным подбором экстрагентов (вроде бы, такое используется в найденной вам ранее статье?) - можно интересные вещи получить. В "красной книжке" (Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств.- М., 1993.- 271 с.) есть вполне понятные блок-схемы работы с различными биожидкостями, помимо каких-то частных методик - для общего представления.
Но мне - в принципе - больше нравится следующий расклад исследования биожидкостей: обнаружение токсикантов проводить в моче, где их концентрации - побольше, а матрица - попроще, жира - поменьше. Для изолирования брать либо несколько отдельных аликвот мочи, а общее изолирование проводить из 10-20-30 мл - чтобы была возможность провести не только предварительное обнаружение (или исключение) методом ТСХ, но и полноценно подтвердить - что же там полезло. А кровь пустить либо на количественное определение (с внутренним стандартом, либо с корректным учетом выхода при изолировании), либо на подтверждение уже найденного в еще одном объекте (который, в отличие от мочи "таки омывает головной мозг").
Поворюсь еще раз: тема - "невпихабельная", но я пока ("в общих-то словах") иссяк. Надеюсь, наши уважаемые коллеги подхватят этот разговор. Успехов!

Сообщение отредактировал chemist-sib - 13.03.2019 - 17:12

[STEEL]

Теперь уже все понятно: стандартная задача - "впихнуть невпихуемое"... - поскольку: на многое, из немного, разом, быстро и чисто. Увы, но общего и универсального решения этой задачи я не знаю. Попробую пояснить - почему. Ну, разделить перечисленные вами группы токсикантов, меняя рН среды - дело понятное: барбитураты - из кислого, оснОвные - из щелочного. Но, скажем, большинство нативных 1,4-бензодиазепинов будут хорошо извлекаться из щелочной водной фазы, а вот седуксен - влегкую пойдет уже из кислой; бОльшая часть производных пиразолона - вещества оснОвного характера, но среди них "затесался" бутадион - "перебезчик" - с кислотными свойствами; барбитураты, в принципе, неплохо извлекаются и из нейтральных, и даже из щелочных водных растворов. Хлороформ из кислой фазы может "вытащить" часть оснОвных веществ (те же самые кстантиновые алкалоиды), эфир из кислой фазы извлечет только барбитураты (ну, и седуксен); для опиатов очень желательно повысить полярность экстрагента (хлороформ + высшие спирты) и не переборщить со щелочью; для фенилалкиламинов - и одного хлороформа хватит, но щелочи нужно поболее. ТСХ, хоть и имеет - по всем нашим указивкам - статус предварительного, с судебно-отрицательным значением, но чувствительность его, во многих случаях, не самая высокая. А концентрация многих токсикантов в крови, наоборот, одна из самых низких - по сравнению с другими возможноыми биообъектами. Особенно это касается опиатов: исключать их в крови по ТСХ - "исследование с гарантированным отрицательным результатом!". Да и с современными психостимуляторами, приблизительно, такая же картина. Барбитураты, анальгин - вот это - пожалуйста! Проявление пластинок - это еще одна "болевая точка": чтобы как-то дифференцировать вещества - нужно, по-хорошему, несколько проявителей. Особенно это касается веществ оснОвного характера (а их среди наших токсикантов - процентов 80, если не больше). Не так много проявителей можно применять последовательно, наслаивая один на другой. У нас "в ходу" только один такой набор: под УФ (но-шпа, курантил, хинин), раствор хлорида железа (III) (группа пиразолона), реактив Драгнедорфа (почти все оснОвные вещества, с третичным и четвертичным азотом), раствор серной кислоты (ксантиновые алкалоиды). Но уже на банальный эфедрин (с его вторичным азотом) реактива Драгендорфа - маловато. Нужен нингидрин. На новые психостимуляторы и этого может оказаться маловато... И еще одна "болевая точка" вопроса - сколько надо наслоить в точку, чтобы по отрицательному результату ТСХ можно было с чистой совестью исключить что-то. Можно, конечно, как говорил у нас один товарищ: "Разбавить побольше, да - по капелькам, по капелькам...". Но вменяемые химики (ИМХО такое!) должны получать отрицательные результаты как-то по-другому... В некоторых методиках прописана аликвота биоматериала, соответствующая этой точке. Для тех же барбитуратов - по методписьму 1974 года - это 4 г (мл). Для опиатов (правда - для мочи и желчи), по методике (Барсегян со товарищи, 2010 г.) это - 2 мл, по одной из статей москвичей в СМЭ - уже 0,3 мл. Мы придерживаемся в общем случае аликвоты, соответствующей 5 г (ил) биоматериала. А ведь желательно еще и подтвердить свой предварительный результат...
Все, "Шахрезада заканчивает дозволенные речи"... До следующего раза (или - до новых вопросов после "подумать").
Пока время появилось - еще несколько мыслей изложу буковками. Пока выше я говорил о нативных веществах, и в свободной форме. В слысле - без предварительного гидролиза. Но собирание множества "осколков" в единый маркер (я - про "наши родные" бензодиазепины и их бензофеноны), а также расщепление водорастворимых связанных форм токсикантов (глюкурониды и сульфаты алкалоидов опия) - это тоже реальный и действенный способ повысить чувствительность всего исследования. Причем, гидролиз может быть и кислотный, и ферментативный. В последние лет 10-15 появилось достаточно много работ (вполне возможно - диссертационных; я специально не отслеживал) по предварительному гидролизу биожидкостей смесью различных ферментов, приводящую к повышению выхода при изолировании и уменьшению предела обнаружения целого ряда веществ оснОвного характера. А если все это сочетнуть с грамотным изменением рН и правильным подбором экстрагентов (вроде бы, такое используется в найденной вам ранее статье?) - можно интересные вещи получить. В "красной книжке" (Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств.- М., 1993.- 271 с.) есть вполне понятные блок-схемы работы с различными биожидкостями, помимо каких-то частных методик - для общего представления.
Но мне - в принципе - больше нравится следующий расклад исследования биожидкостей: обнаружение токсикантов проводить в моче, где их концентрации - побольше, а матрица - попроще, жира - поменьше. Для изолирования брать либо несколько отдельных аликвот мочи, а общее изолирование проводить из 10-20-30 мл - чтобы была возможность провести не только предварительное обнаружение (или исключение) методом ТСХ, но и полноценно подтвердить - что же там полезло. А кровь пустить либо на количественное определение (с внутренним стандартом, либо с корректным учетом выхода при изолировании), либо на подтверждение уже найденного в еще одном объекте (который, в отличие от мочи "таки омывает головной мозг").
Поворюсь еще раз: тема - "невпихабельная", но я пока ("в общих-то словах") иссяк. Надеюсь, наши уважаемые коллеги подхватят этот разговор. Успехов!

Спасибо за столь обширный ответ. С гидролизом то все понятно, это у меня идет как дублирующая методика (БАрцев или Барсегян - желчь, моча). А вот экстракцию из крови предпологал как классический метод в миниатюре.


Про Изотова хорошо подсказали, есть у него методика по экстракции (моча) только по методике требуется 50 мл по-моему. Ну в принципе в кратное количество уменьшить и делать. Благодарю за содействие.

[chemist-sib]

...по методике требуется 50 мл по-моему. Ну в принципе в кратное количество уменьшить и делать..

Вы можете и из 5 мл делать, главное - подумать, на сколько точек на пластинку извлечение наслаивать. И еще один маленький совет (который, надеюсь, потом понравится): делайте экстракцию во флаконах (подходящих по объему выбранной аликовоте биожидкости и емкости ротора центрифуги - от 10 до 100 мл), в них - и гидролизуйте (при необходимости), в них - и выбалтывайте (смело, не боясь!), в них - и центрифугируйте, а органический слой отбирайте пастеровской пипеткой. И по делительным воронках - не размажется, и вазелин со шлифов не помешает. Быстрее, удобнее, эффективней. Лаборанты поначалу могут сопротивляться (как и всякому новому), но потом и им - понравится. Успехов!

[STEEL]

Спасибо!

[АМД]

Подхватить тему особо не получиться, потому что как выше написАл коллега, в крови методом ТСХ реально обнаружить только барбитураты и анальгин. И на этом все. Остальные вещества только другими методами. За неразрешимые задачи лучше не браться.

[LisSB]

Подхватить тему особо не получиться, потому что как выше написАл коллега, в крови методом ТСХ реально обнаружить только барбитураты и анальгин. И на этом все. Остальные вещества только другими методами. За неразрешимые задачи лучше не браться.

ВЭТСХ МЕРК пластинки на стекле 5х5, дают открытие на уровне 10-100 нг/мл, так что спектр можно расширить, а при закупке модуля CAMAG ещё и масс-спектрометрию провести

[Nerazzurri]

ВЭТСХ МЕРК пластинки на стекле 5х5, дают открытие на уровне 10-100 нг/мл, так что спектр можно расширить, а при закупке модуля CAMAG ещё и масс-спектрометрию провести

Ну так люди за пределами Нерезиновой же работают на ТСХ потому что им так хочется, и ВЭТСХ Мерковскую купить могут, когда хотят, да и модулями завалились уже.

Теоретизируя, мы можем говорить и о том, что на Орбитрэпе можно делать что-то из наших проб. Только вот сколько их в РФ вообще? Вернитесь в реальность, люди работают на ТСХ потому что у них денег нет, и никогда не будет. Тем более в БСМЭ.

[LisSB]

Ну так люди за пределами Нерезиновой же работают на ТСХ потому что им так хочется, и ВЭТСХ Мерковскую купить могут, когда хотят, да и модулями завалились уже.

Теоретизируя, мы можем говорить и о том, что на Орбитрэпе можно делать что-то из наших проб. Только вот сколько их в РФ вообще? Вернитесь в реальность, люди работают на ТСХ потому что у них денег нет, и никогда не будет. Тем более в БСМЭ.

Ну можно и по старинке открывать, как было 100 лет назад, просто проводить хоть что-нибудь, ведь что-то делать надо же, а если ещё и результат будет, можно сказать, ну вот ведь работаем...неважно, что это будет 1% от того, что нужно.
Может пора задуматься об эффективности работы, по крайней мере пластины МЕРК, дорого, но не заоблачно, как Орбитрэп, да и Сорбфил обещал "исправиться" и модернизироваться, поживём, увидим...
Или так и будем сидеть, как "старуха у разбитого корыта"...

Сообщение отредактировал LisSB - 16.03.2019 - 09:46

[chemist-sib]

...Или так и будем сидеть, как "старуха у разбитого корыта"...

До тех пор, пока всем заправляет "золотая рыбка", лишь "хвостом бьющая" в своем "синем море" ("Денег нет. Но вы держитесь!..") - похоже, да... Честно оценить свои возможности и не обещать невыполнимого - это ведь тоже профессионализм.

[LisSB]

До тех пор, пока всем заправляет "золотая рыбка", лишь "хвостом бьющая" в своем "синем море" ("Денег нет. Но вы держитесь!..") - похоже, да... Честно оценить свои возможности и не обещать невыполнимого - это ведь тоже профессионализм.

А куда наши "левши" подевались?!
Цитата ученика: Левша относится к своей работе хорошо, он её уважает .Левша обозначает талантливого человека из народа, с "Золотыми руками"
и нечего на Рыбку пенять, она Нерезиновая...

Сообщение отредактировал LisSB - 16.03.2019 - 09:55

[Nerazzurri]

А куда наши "левши" подевались?!
Цитата ученика: Левша относится к своей работе хорошо, он её уважает .Левша обозначает талантливого человека из народа, с "Золотыми руками"
и нечего на Рыбку пенять, она Нерезиновая...

Если вы мне лично покажете, как ТСХ (ладно еще не бумажной), находить в крови какие-нибудь синтетические аналоги каннабиноидов, или, скажем карфентанил, я готов взять отпуск за свой счет и пожить на кафедре, но это ж все болтовня.

P.S. Я когда читаю ваши ответы, у меня складывается ощущение, что это неройсеть пишет.

[LisSB]

Если вы мне лично покажете, как ТСХ (ладно еще не бумажной), находить в крови какие-нибудь синтетические аналоги каннабиноидов, или, скажем карфентанил, я готов взять отпуск за свой счет и пожить на кафедре, но это ж все болтовня.

P.S. Я когда читаю ваши ответы, у меня складывается ощущение, что это неройсеть пишет.

Отчего Вас так тянет на максимумы, то ничего нельзя сделать, то сразу карфентанил и синтетические аналоги каннабиноидов в крови
жить на кафедре запрещено правилами внутреннего распорядка
а вот всех желающих общаться лично, да ещё и по делу, рады видеть на кафедре всегда, только по предварительной договорённости (увы, несвободна работа и дела личного характера) или на курсах повышения квалификации

Р.S. Рыть можно яму, искусственную нейросеть создавать и обучать, а природная существует миллиарды лет, но, до сих пор, до конца не изучена из-за своей уникальности