[Зубр]

Уважаемые коллеги!
Открываю раздел по методическим подходам экстракции геномной ДНК из костной ткани. Тема становится всё более актуальной. Вывешу для начала интересные исследования в данной области.

 MethodsEnzymology.rar ( 91.71 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1902

 bone_DNA.rar ( 309.99 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1709

 ___________.rar ( 55.28 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1640

[Хонки-Тонки]

Здравствуйте. Подскажите, проводите ли вы декальцинацию костного материала перед выделением ДНК, и какой способ предпочитаете?

[Зубр]

Здравствуйте. Подскажите, проводите ли вы декальцинацию костного материала перед выделением ДНК, и какой способ предпочитаете?

Уважаемый 'Хонки-Тонки'!
У нас в отделении отработана методика получения ДНК из костной ткани с длительной (78 часов и более) декальцификацией. Поначалу пробовали и без декальцификации делать, но столкнулись со следующей проблемой: нестабильность конечного результата (то получается пригодная к амплификации ДНК, то не получается). Пришли к выводу, что декальцификация вносит определённый элемент стабильности в получаемый результат. "Проходим" почти все кости, которые к нам поступают. Для кости средней сохранности - нужно около 5г порошка. Трубчатые кости лучше получаются, чем кости черепа, лопатки и позвонки. Но иногда, удивительно хорошо ведут себя кости стопы и кисти.
Всего наилучшего.

[Хонки-Тонки]

Спасибо. Попробуем применить и мы. Ситуация, когда приблизительно в половине случаев по материалам, связанным с исследованием костных останков, результаты либо отрицательные либо труднотрактуемые, не очень устраивает.

[ramail]

Здравствуйте, уважаемый зубр.
Меня интересует вопрос подготовки костей к выделению. Отделяете ли вы остатки мышечной ткани, и обрабатываете ли вы кости перекисью? Поделитесь, пожалуйста, опытом. Стоит ли проводить декальцификацию в случаях с гнилыми костями?
Каким набором праймеров вы пользуетесь при анализе костной ДНК?

[Зубр]

Меня интересует вопрос подготовки костей к выделению. Отделяете ли вы остатки мышечной ткани, и обрабатываете ли вы кости перекисью? Поделитесь, пожалуйста, опытом. Стоит ли проводить декальцификацию в случаях с гнилыми костями?
Каким набором праймеров вы пользуетесь при анализе костной ДНК?

Уважаемый 'ramail'!
От мышечной ткани стараемся избавиться полностью, как и от костного мозга внутри трубчатых костей. Другое дело, когда фрагменты высохших мышц обнаруживаются на внешней поверхности кости. Тогда параллельно выделяем ДНК из кусочков снятых с кости мышечной ткани, иногда мышца срабатывает и получение ДНК из костной ткани отменяется. Перекисью не обрабатываем. Дистиллированная вода и этиловый спирт. Как уже писал - декальцификацию проводим всегда, с любыми костями.
Успехов.
Да, ещё про наборы. STRы производства АТГ "Биотех", Москва, Applied Biosystems (Identifiler, Y-filer). Могут применяться и другие - главное пробоподготовка!

[ramail]

Большое спасибо за столь быстрый ответ.
Однако нельзя ли по подробней про спирт и дистиллированную воду (процентность и время)?

[Зубр]

Большое спасибо за столь быстрый ответ.
Однако нельзя ли по подробней про спирт и дистиллированную воду (процентность и время)?

Первый этап. Выбор кости из которой будет произведён выпил (или места на кости) и реализация последнего.
Второй этап. Очистка фрагмента кости снаружи и внутри (если трубчатая). Всё под струёй воды в раковине.
Третий этап. Последовательное погружение на несколько минут в каждый раствор фрагмента в дист воду - спирт 96 - дист воду.
Четвёртый этап. Высушивание на воздухе 12 часов.
Пятый этап. Дробление кости в ступке из металла (сталь нерж, бронза) до состояния мелких опилок, но не муки.
Шестой этап. Декальцификация и так далее...

[ramail]

Вы говорите, кости надо перемалывать до стружки? А чем плох порошок?

[Зубр]

Вы говорите, кости надо перемалывать до стружки? А чем плох порошок?

Порошок плохо оседает при декальцификации, даже при центрифугировании. Кроме того, для того, чтобы добиться состояния порошка, надо либо использовать особые мельницы с охлаждением, либо пилить, что приводит к избыточному нагреванию материала. Удобнее работать с мелкими опилками. Позже приведу фотографию.

[ramail]

А скажите, пожалуйста, в какой пропорции заливаете лиз. буфер. И на какое время. В одной из статей, предлагаемых Вами, есть методика, по которой кости выдерживают в лиз. буфере почти неделю. Как время сказывается на структуру и стабильность костной ДНК? Существует ли риск передержать костный порощок в лиз.буфере?

[Зубр]

А скажите, пожалуйста, в какой пропорции заливаете лиз. буфер. И на какое время. В одной из статей, предлагаемых Вами, есть методика, по которой кости выдерживают в лиз. буфере почти неделю. Как время сказывается на структуру и стабильность костной ДНК? Существует ли риск передержать костный порощок в лиз.буфере?

Уважаемый 'ramail', в лизирующем буфере материалу кости находиться надо 18-24 часа, но не более 24. Эффективность работы протеиназы катастрофически падает после нескольких часов работы, а выходящие в раствор нуклеазы - не дремлют Поэтому, если опилки после ночи лизиса на 80% растворились, то лучше взять этот раствор для дальнейшей работы (на всякий случай заморозив оставшийся нелизированным материал).
Успехов.

[Зубр]

Доброго времени суток уважаемые форумчане!
Как обещал, привожу фото.

Начальный этап - выпил кольца трубчатой кости.


Получено примерно 2 г опилок.


На следующем кадре стрелками отмечены типичные фрагментики.


Всем привет.

[Викто]

Уважаемые коллеги!
Открываю раздел по методическим подходам экстракции геномной ДНК из костной ткани. Тема становится всё более актуальной. Вывешу для начала интересные исследования в данной области.

 MethodsEnzymology.rar ( 91.71 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1902

 bone_DNA.rar ( 309.99 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1709

 ___________.rar ( 55.28 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1640

Уважаемые судебные медики!
Много лет работал с Вами и высоко ценю Ваши знания и опыт.
Сейчас, находясь на пенсии и проживая в государстве Израиль, стал использовать свои навыки в розыске пропавших без вести солдат. За это кстати, предусмотрена солидная денежная премия.
Путем тщательного расследования и оперативного и следственных действий в предполагаемом мною месте я нашел фрагмент кости. Этот фрагмент я сдал в установленном порядке в полицию, откуда это было отправлено на экспертизу. Был получен ответ, что это действительно кость человека, но определить ДНК или не смогли или не захотели отписавшись, что по данному фрагменту определить ДНК не представилось возможным. Хотя фрагмент представляет собой половину трубчатой кости левого предплечья размером около 9 см в длину и около 3 см в ширину - фото имеется. В кости даже сохранилось мозговое вещество, а сверху визуально видны остатки ткани, что я и опытный врач определили как срок от 4 до 8 лет нахождения в земле. Поэтому у меня большие сомнения, что ответ местной экспертизы верен.
Если кто-то сочтет уместным ответить снисходительно на мое невежество буду крайне признателен.
С уважением Виктор Нарыжный, опер на пенсии, писатель

[Зубр]

... я нашел фрагмент кости. Этот фрагмент я сдал в установленном порядке в полицию, откуда это было отправлено на экспертизу. Был получен ответ, что это действительно кость человека, но определить ДНК или не смогли или не захотели отписавшись, что по данному фрагменту определить ДНК не представилось возможным. Хотя фрагмент представляет собой половину трубчатой кости левого предплечья размером около 9 см в длину и около 3 см в ширину - фото имеется. В кости даже сохранилось мозговое вещество, а сверху визуально видны остатки ткани, что я и опытный врач определили как срок от 4 до 8 лет нахождения в земле...

Уважаемый 'Викто',
Сначала этот фрагмент надо увидеть, потом попробовать получить препарат ДНК и оценить пригодна ли полученная ДНК для генетического анализа. К сожалению, эмпирически на Ваш вопрос ответить невозможно.
Успехов