[Зубр]

Доброго времени суток уважаемые форумчане!
По предложению коллеги Elena blond, открываю данный раздел, где предлагается выкладывать интересные, особо сложные, необычные и т.д. молекулярно-генетические экспертизы, выполненные Вами лично, или коллегами из Вашей лаборатории. Сам и начну изложение.
Фабула: изнасилована женщина, в мазках и тампонах обнаружено малое количество сперматозоидов без примеси крови. У следствия есть трое подозреваемых. Экспертиза поступает на генетику.
По результатам: двое подозреваемых исключены, а третий - не исключается. Ставили 15 STR - систем на секвенаторе + пол. В целом, рядовая экспертиза, но есть интересная деталь. У подозреваемого типируется только участок амелогенина, находящийся на Y -хромосоме, а тот, что на Х -хромосоме - нет.
Посмотрите картинку:



Версия такая: нарушено место прикрепления праймера/ов амелогенина на Х-хромосоме. Но это только версия, проверить сложно - надо секвенировать весь участок.
Всего наилучшего.

[Elena blond]

У подозреваемого типируется только участок амелогенина, находящийся на Y -хромосоме, а тот, что на Х -хромосоме -нет.
Версия такая: нарушено место прикрепления праймера/ов амелогенина на Х-хромосоме. Но это только версия, проверить сложно - надо секвенировать весь участок.

Всем привет.
Этот случай интересный, но здесь хотя бы в том, что это мужчина сомневаться не приходилось.
У меня была экспертиза (отцовство).
Как обычно, прелюдия перед экспертизой - ругань на всю лабораторию между участниками исследования (в нашей лаборатории главное требование для экспертиз по суду - присутствие всех троих в одно и тоже время)
Начала исследование. Образец папы выходил в Identifiler как женский, поскольку был лишь один "X",
"Y" не было в помине. Глаза округлились, мысли всякие нехорошие полезли.
Перевыделила ДНК и переставила в секвинаторе. Результат тот же.
Благо он не исключался как отец (стало как-то спокойнее).
Потом догадалась поставить Y-filer, благо ребенок был мужского пола, и поэтому исследование проводилось не зря.
Тоже пришлось объяснять данный факт хромосомной мутацией.

PS: Позже мы выяснили, что такие аномалии часто встречаются у мужчин-выходцев из Востока.
Представляете, а если такая мутация встретится в экспертизе...?!

[someone]

Посмотрите картинку

жесть

[Genetik]

У меня была экспертиза (отцовство). Образец папы выходил в Identifiler как женский, поскольку был лишь один "X",
"Y" не было в помине. Глаза округлились, мысли всякие нехорошие полезли.
Перевыделила ДНК и переставила в секвинаторе. Результат тот же. Благо он не исключался как отец (стало как-то спокойнее). Потом догадалась поставить Y-filer, благо ребенок был мужского пола, и поэтому исследование проводилось не зря. Тоже пришлось объяснять данный факт хромосомной мутацией.

Уважаемая Elena blond! В нашей практике тоже были аналогичные случаи. Скорее всего у этого мужчины имеется делеция в месте посадки одного из амелогениновых праймеров. Я бы порекомендовал поработать с олигами на другие участки локуса Amelogenin, благо есть из чего выбрать.
Если не сложно, не могли бы Вы выложить картинку (фореграмму) результатов Identifiler этого папаши?
Удачи.

 41676003.pdf ( 11.49 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1012

[Elena blond]

Уважаемая Elena blond! В нашей практике тоже были аналогичные случаи. Скорее всего у этого мужчины имеется делеция в месте посадки одного из амелогениновых праймеров. Я бы порекомендовал поработать с олигами на другие участки локуса Amelogenin, благо есть из чего выбрать.
Если не сложно, не могли бы Вы выложить картинку (фореграмму) результатов Identifiler этого папаши?

Приветствую всех форумчан, а в особенности Genetik!
Конечно я найду данный профиль в компьютере и готова буду его выложить. Я так понимаю, что вас интересует фрагмент фореграммы с Amel и локусами с красным флуоресцентным красителем (PET).
В выходные попробую разобраться, как это делается технически.

PS: Спасибо за одобрительные слова, высказанные в наш адрес в дебатах по самолёту.

Всего хорошего.

[Elena blond]

В нашей практике тоже были аналогичные случаи. Скорее всего у этого мужчины имеется делеция в месте посадки одного из амелогениновых праймеров. Я бы порекомендовал поработать с олигами на другие участки локуса Amelogenin, благо есть из чего выбрать.
Если не сложно, не могли бы Вы выложить картинку (фореграмму) результатов Identifiler этого папаши?

Уважаемый Genetik,
по Вашей просьбе я отыскала эту экспертизу.
Попытаюсь вставить картинку, надеюсь она получилась неплохого качества.
Прошу прощения за то, что ввела народ немного в заблуждение, поскольку ребенок в той экспертизе был женского пола, а не мужского как писала ранее.
Однако, я всё же ставила Y-filer и определяла количество ДНК Y-хромосомы на Real-Time, чтобы реабилитировать мужчину в данной экспертизе.
Количества ДНК были такими:
Quantifiler Human - 10,79 нг/мкл
Quantifiler Y - 7,99 нг/мкл
Картинку по Identifiler прилагаю.
Всего наилучшего.

[Зубр]

Доброго времени суток, уважаемые коллеги!
Вот эта статья как раз в тему. Правда досконально исследуется только случай отсутствия аллели на Х-хромосоме. Но, обратите внимание, случаи таких мутаций не так уж редки.

 Gender_id.rar ( 539.82 килобайт ) Кол-во скачиваний:  753

Всем привет.

[Genetik]

Попытаюсь вставить картинку, надеюсь она получилась неплохого качества.

Уважаемая Elena blond! Спасибо за картинку. А Вы случайно не интересовались национальностью этого "папы"?

С уважением.

[Genetik]

Доброго времени суток, уважаемые коллеги!
Вот эта статья как раз в тему. Правда досконально исследуется только случай отсутствия аллели на Х-хромосоме. Но, обратите внимание, случаи таких мутаций не так уж редки.

Уважаемый 'Зубр'! Статья интересная, однако предложенные авторами праймеры на амелогениновый участок не очень удобны (по крайней мере для нашей лаборатории): не всегда удается получить амплификат длинной 212 (218) bp из объектов с малым содержанием активной ДНК-матрицы (в отличие от стандартных праймеров). В особенности это касается старых вещдоков, горелых биообъектов и другой прочей прелести. А что касается массовых идентификаций, то вероятность напороться на такую мутацию крайне редка (если мы конечно не будем идентифицировать каких-нибудь индийцев или жителей Шри Ланки). А с учетом того, что народ при идентификации массовых жертв пользуются не только генетическими методами определения пола, так вообще, вероятность ошибки исчезающе мала.

С уважением.

[Elena blond]

Уважаемая Elena blond! Спасибо за картинку. А Вы случайно не интересовались национальностью этого "папы"?

Уважаемый Genetik!
Возможности такой у нас не было, поскольку отцовство было по суду. Это значит, что мы видим участников экспертизы один раз, когда производим забор материала на исследование. По окончании экспертизы "Заключение эксперта" высылается почтой.
Но, судя по ФИО и месту рождения - должен быть славянской национальности.
Сам папа приехал на экспертизу с области севернее нашей.
Посему, остается только предполагать...
Всего хорошего.

[Elena blond]

Уважаемые форумчане!
Была ли у вас ситуация подобная нашей?
Или может быть у вас имеется логическое объяснение данному факту?

На исследование представлено два марлевых тампона-смыва с порога автомобиля.
На них явная кровь хорошей насыщенности.
Эксперт-биолог установил в них кровь человека.
Выделяли ДНК два раза: первый - фенольным методом (набором АТГ-Москва), второй раз - колонками и набором QIAamp DNA mini Kit (фирмы Qiagen).
Количество ДНК ничтожно малое, и даже после концентрирования в секвенаторе ничего не идет.
Стали перепроверять кровь на вид. И вот каков расклад:
- по результатам теста на гемоглобин человека - TEST HemDirect - результат отрицательный, при этом тест сработал хорошо: контрольная полоска хорошая, тестовая - даже намёков нет.
- по результатам реакции Чистовича - чистый человек с двумя сериями сывороток. Со всеми имеющимися животинками (сыворотками) ставили - реакция отрицательная.
Что делать с этой экспертизой неясно.

Заранее благодарна за ответы.
Всего наилучшего.

[Зубр]

...Что делать с этой экспертизой неясно...

Уважаемая коллега 'Elena blond'!
Если вопрос касается только того, как выпустить генетическую экспертизу, то это тот неприятный для эксперта случай, когда он вынужден писать отрицательный результат генотипирования. При том, что сделано всё возможное, чтобы добиться положительного результата (судя по Вашему сообщению - Вы сделали максимум возможного). Назвать причину описанного Вами явления, полагаю, не сможет никто: это требует непосредственного изучения и немалого числа дополнительных данных. Возможно в этом я ошибаюсь и у кого-то есть такие или подобные случаи, которые удалось осмыслить.
Другой вопрос: зачем Вы проверяли биологические данные? Любой результат такой перепроверки кроме головной боли Вам ничего не даст.
Вообще-то, с тампонов-смывов ДНК всегда выделяется неважнецки. Вы говорите, что ДНК мало (кстати, допустимый порог требуемый для генотипирования превышен или нет?), плюс следы крови могли находиться на солнце или в местах авто, где бензин, масло и другие компоненты присутствуют. Среди всего этого добра много ингибиторов ПЦР.
Что мы делаем в подобных случаях?
1. Выделение ДНК из очень малого фрагмента тампона (примерно 2на 2 мм) и из большого (около 3на 3см), зависит от слойности и насыщенности.
2. Предварительное нагревание фрагмента в воде (pre-soaking) при 56градусах один час. Дальше вытаскиваем фрагмент и - в переваривающий буфер.
3. Увеличиваем количество фенольно-хлороформных экспозиций до 6.
4. Переосаждаем не этанолом, а изопропанолом.
5. Титруем ДНК вводя её в амплификацию.
6. Добавляем больше бычьего сывороточного альбумина в амплификацию.
7. Проводим монолокусные реакции (они чуствительнее) или ставим тест на сегмент гена амелогенин - всё в "ручном" режиме.
8. Можно продолжать ещё долго...
Успехов.

[Elena blond]

Другой вопрос: зачем Вы проверяли биологические данные? Любой результат такой перепроверки кроме головной боли Вам ничего не даст.

Потому, что первая мысль, которая возникла после получения результатов, может это кровь животного.

Вы говорите, что ДНК мало (кстати, допустимый порог требуемый для генотипирования превышен или нет?)

-при выделении фенольным набором - количества ДНК было достаточным для генотипирования, но в секвенаторе - пусто по всем локусам.
-при выделении колонками Qiagen - количество ДНК не достаточное для генотипирования.
Иногда, при концентрации ДНК ниже допустимого порога указанного в протоколе, в секвенаторе выходит замечательный профиль. Но там количество ДНК настолько низкое, что даже пробовать амплифицировать смысла не имеет.

Ни в первом, ни во-втором случае ингибиции не было, о чем свидетельствует прекрасная наработка ДНК внутреннего контроля (IPC) в данных образцах в Real-Time.
Большинство методов борьбы, которые перечислили Вы, если я не ошибаюсь, направлены на устранение влияния ингибиторов на ПЦР.
Но нам, это вряд ли поможет.
Тем не менее, за развернутый ответ спасибо.

Вообще-то, с тампонов-смывов ДНК всегда выделяется неважнецки.

Я бы так не стала говорить, иногда на вид смыв ужасный, а ДНК выделяется прекрасно и количество больше, чем достаточно, по крайней мере, для секвенатора.
Всего наилучшего.

[Зубр]

Уважаемая колега 'Elena blond' !

Потому, что первая мысль, которая возникла после получения результатов, может это кровь животного.

Конечно, я не профессиональную этику имел в виду, когдаспрашивал о цели перепроверки судебно-биологической экспертизы. Но, если рассуждать логически, показала бы проверка, что кровь не человека. И что дальше? Две экспертизы вступают в непримиримое противоречие. При этом, генетики взялись за несвойственные им методы (ну не совсем свойственные, пока не свойственные , словом, не ДНК-овые). Кому должен верить Суд? Трудно будет Суду .

-при выделении фенольным набором - количества ДНК было достаточным для генотипирования, но в секвенаторе - пусто по всем локусам.
-при выделении колонками Qiagen - количество ДНК не достаточное для генотипирования.

Загадка...

...Но там количество ДНК настолько низкое, что даже пробовать амплифицировать смысла не имеет.

А может всё же попробовать?

Я бы так не стала говорить, иногда на вид смыв ужасный, а ДНК выделяется прекрасно и количество больше, чем достаточно, по крайней мере, для секвенатора.

Так-то оно так, всякое бывает, не спорю. Я же про статистику говорю, у нас каждый третий (может пятый) тампон - проблема. Один милиционер не нашёл воды поблизости и смочил ватный тампон, которым с бампера автомобиля след крови снимал, - собственной слюной... . Пример не в тему чуть-чуть, извините.

Всего наилучшего

[rostandrei]

...У подозреваемого типируется только участок амелогенина, находящийся на Y -хромосоме, а тот, что на Х - хромосоме - нет. Посмотрите картинку:
Версия такая: нарушено место прикрепления праймера/ов амелогенина на Х-хромосоме. Но это только версия, проверить сложно - надо секвенировать весь участок.

Вот нечто подобное. В данном случае типирована ДНК выделенная из кости НТ. Предполагалась что это пропавшая без вести, оказалось что пропавший. Выделять ДНК приходилось дважды. Как оказалось она деградирована. Для анализа использовал реактивы PowerPlex 16 System, так как по моему мнению промеговские наборы менее чувствительны к ингибиторам. Однако и с ними ничего не выходило, только смесь (по 4 пика) в локусах D3S1358 и D5S818. Тут кстати подоспел новый набор от А/В MiniFiler (специально оптимизирован для деградированной ДНК) с ним то и получилась вот такая картинка.