[Зубр]

Уважаемый коллега 'rostandrei'!
Я бы не рискнул говорить по данной картинке, что Х-хромосома (амелогениновый участок) отсутствует. В приведённом мною случае - был чётко работающий (по остальным системам) образец, а в Вашем случае - сложный объект. Было бы очень интересно по приведённому Вами случаю узнать подробности. Где нашли останки, в каких условиях и как долго они там находились? Какую кость брали для генанализа, как обрабатывали, м.б., какие-то подробности выделения и очистки ДНК?

Всего наилучшего.

[rostandrei]

Здравствуйте уважаемые участники форума и уважаемый коллега Зубр.
Про кость. По обстоятельствам дела череп обнаружен в теплотрассе в апреле 2007 г. Нашли уже голый череп, из чего можно предположить, что голова потерпевшего находилась там довольно долго. Пропавшая без вести молодая женщина. Измерения краниометрических параметров не проводил, но на вид череп больше напоминал мужской и по размеру был крупноват для женщины (хотя всякое бывает). Для исследования использовал затылочную кость. Выделение ДНК из кости только фенольным методом. Первый раз выделение проводил параллельно из двух разных объектов (костей по разным делам). Одна кость получилась хорошо, вторая (эта самая) – почти нет. Второй раз выделял только из этой кости, но параллельно в двух пробах, на каждую брал по 4 г костного помола.
Думаю что отсутствие пика Х специфичных фрагментов в данном случае обусловлено частичной гнилостной деградацией ДНК. В локусе D7S820 характерная для смеси картина. С интерпретацией пиков затрудняюсь. То что 11 аллель есть сомнений не вызывает, а вот как быть с 8, 9, 10 не знаю. Локус D18S51 тоже с «сюрпризом» - 18. Аналогичная картина с четырьмя пиками наблюдалась и в упомянутых ранее локусах D3S1358 и D5S818.
Дело в том, что при последнем выделении препарат подвергался сильному концентрированию. Вначале при помощи Centricon 100, потом Microcon 100. При таком концентрировании приходится работать с особой осторожностью, но избежать контаминации не всегда удается. Наличие лишних пиков тому свидетельство.
Чтобы избавиться от наверняка присутствующих ингибиторов, которые могли сконцентрироваться вместе с ДНК, проводил так называемую доочистку, с помощью набора реагентов «DNA IQ System». Особенность набора в том, что входящие в его состав шарики адсорбируют на себя ДНК (нечеловеческую тоже), а все остальное остается в растворе.
Качественную и количественную оценку ДНК в «Реалтайм» не проводил. Методически это конечно же неверно, но есть кое какие объяснения, о них потом.
С уважением, rostandrei.

[Зубр]

Уважаемый коллега 'rostandrei'!
Спасибо за информативный рассказ. Несколько соображений выскажу.

По обстоятельствам дела череп обнаружен в теплотрассе в апреле 2007 г. Нашли уже голый череп, из чего можно предположить, что голова потерпевшего находилась там довольно долго.

Из нашего опыта - особенно сложный костный материал - это погружённые в воду тела, либо находившиеся длительное время в контакте с водой. На теплотрассе постоянное сочетание пара с колебанием температуры. Был аналогичный случай - "пробили" с трудом.

... Для исследования использовал затылочную кость. Выделение ДНК из кости только фенольным методом.

По литературным данным, кости черепа наименее пригодны для получения препаратов ДНК, при этом, предпочтение следует отдавать нижней челюсти.

Дело в том, что при последнем выделении препарат подвергался сильному концентрированию. Вначале при помощи Centricon 100, потом Microcon 100. При таком концентрировании приходится работать с особой осторожностью, но избежать контаминации не всегда удается. Наличие лишних пиков тому свидетельство.

Возможно, это консерватизм, но я предпочитаю концентрировать ДНК дедовским способом: переосаждение изопропанолом. Кости (не образцы) приходится переосаждать почти всегда.

Всего наилучшего.

[Genetik]

Уважаемый rostandrei! На вашей фореграмме показан типичный случай контаминации образца, содержащего изначально малое кол-во активной ДНК-матрицы. Прошу обратить Ваше внимание на локус CSF1PO: здесь возможен случай ложной гомозиготы. Были ли доступны в Вашем случае зубы? Если да, то я бы попробовал с парочкой из них повозиться. Гарантия на частоту повыше, да и надежность получить истинный генотип тоже.
С комсомольским приветом.

[rostandrei]

Уважаемый rostandrei! На вашей фореграмме показан типичный случай контаминации образца, содержащего изначально малое кол-во активной ДНК-матрицы. Прошу обратить Ваше внимание на локус CSF1PO: здесь возможен случай ложной гомозиготы. Были ли доступны в Вашем случае зубы? Если да, то я бы попробовал с парочкой из них повозиться. Гарантия на частоту повыше, да и надежность получить истинный генотип тоже.
С комсомольским приветом.

Уважаемый Genetik, к сожалению все зубы ни нижняя челюсть отсутствовали. По славам следователя череп представлен в том виде в котором был найден. Может когда-нибудь найдётся и склет без черепа. Предотвратить контаминацию при изначально малой концентрации ДНК очень проблематично, видимо при сильном концентрировании она практически из воздуха происходит. Перед работой надо помещение УФ-том с часик "прожарить".
С пионерским приветом.

[Gordiz]

Уважаемые коллеги!

Вероятно описанный ниже образец может быть отнесен ва разряд интересных случаев.

При анализе выборки неродственных индивидов попался образец с тремя аллелями в локусе D21S11.



Видно, что образец не смешаный. Для D21S11 описано множество три-аллельных генотипов. Вроде бы ничего особенного. Смущало только, что соседний SE33 гомозиготен, что случается довольно редко при гетерозиготности локуса >95%. Кроме того третий аллель D21 какой-то странный: ранее не описанный промежуточный аллель, подозрительно похожий по интенсивности на гомозиготу SE33.

При постановке D21S11 и SE33 в моноплексах выяснилось, что третий аллель D21S11 - на самом деле первый аллель SE33. Точнее минус первый, потому что если пересчитать его подвижность на число повторов, то получится -1.



Анализ образца с другим набором праймеров подтвердил генотип SE33.

Полезно было узнать, что бывает и такое.

[Зубр]

Уважаемые коллеги!
Прошу высказать Ваше мнение, может быть сталкивались с аналогичными ситуациями, по следующему случаю. В лесополосе обнаружены скелетированные останки мужчины. У следствия возникла версия о принадлежности останков некоему Б. Чтобы эту гипотезу доказать назначается генетическая экспертиза. Из родственников у "Б". только родной брат "К". Делаем Y-filer и получаем 16 совпадений и по 17-ой системе отличие. Что тут думать: мутация. Но решили проверить по митохондриальной ДНК, раз братья единоутробные, т.е. от одной матери. Получаем 4 чётких (области секвенированы дважды) отличия между "Б" и "К". В МтДНК сомнений нет, но основной вопрос по Y- маркерам. Могут ли неродственники дать совпадение по 16 системам?
Всем привет.

[someone]

Могут ли неродственники дать совпадение по 16 системам?

16/17 это значит общему предку может быть до 700 лет (типа того), так что в теории вполне могут не быть близкими родственниками, запросто могут иметь разные фамилии и о своем родстве ничего не знать. Но в реальной практике 16/17 действительно бывает не часто, и Ваше удивление и первоначальное подозрение что это мутация 100% законны, ув. Зубр!

Сюрприз в том что реальная дата общего предка обычно моложе чем в теории которая накручивает ее для уменьшения CI. Практически родству таких мужчин до пары-тройки сот лет, особенно если дело было в одной области/районе и тем более если это глухое сельское место где популяция маленькая и все что похоже то и родственно Увы, я пока не встречал работ где бы анализировалась большая выборка с разбором всех случаев совпадения 16/17, с целью выяснить могут ли они оказаться родственниками. Все что есть - это либо анализ мутирования в семьях с заведомо верной генеалогией, либо, еще реже - фамильные студии.

Западные работы по мутированию микросателлит в семьях с глубокой генеалогией известны, можно при желании нарыть средний возраст одной мутации при условии что древо известно. По России на У-файлере есть любопытная иллюстрация есть на сайте Генофонд, проект Родственники или Однофамильцы:

http://genofond.ru/default3.aspx?s=0&p=549

Однофамильцы с близкими гаплотипами там закрашены одним цветом, расстояние более чем 16/17 следует игнорировать (там уже начинаются случайности), 17/17 имхо это в основном случаи когда участники вводили в заблуждение проект присылая киты заведомых родственников (что запрещено правилами), а вот 16/17 заслуживает внимания. В большинстве групп однофамильцев такие пары есть (тогда как у пар с разными фамилиями 16/17 исключительная штука), так что в пределах жизни одной фамилии (простой, не аристократической) 1 отличие на 17 набегает запросто и не раз. Что интуитивно совершенно очевидно

Сообщение отредактировал someone - 21.02.2010 - 14:39

[Gordiz]

Могут ли неродственники дать совпадение по 16 системам?

Уважаемый Зубр!

В прикрепленном файле результаты типирования Y-STR 656 неродственных мужчин из США. По локусам Yfiler 12 гаплотипов встретились в выборке 2 раза и 2 гаплотипа встретились 3 раза. Это полные совпадения. С одним мисматчем "случайных" совпадений будет гораздо больше.

 Decker_AAFS2006_Y.pdf ( 252.03 килобайт ) Кол-во скачиваний:  1002


С другой стороны, если суммировать частоту мутаций локусов Yfiler получится вероятность хотя бы одной мутации - 5% на поколение. То есть в каждой 10-й паре сибсов будет хотя бы одна мутация.

Про мтДНК временами публикуют разные чудеса. Поэтому вероятность подвоха с этой стороны тоже не равна нулю.

Можно использовать дополнительные средства:

1. На уровне сибсов и полусибсов достаточно достоверно можно провести сравнение с помощью аутосомных маркеров, если взять в анализ много локусов (>25).

2. Можно воспользоваться маркерами X хромосомы. Из четырех групп сцепления X хромосомы с высокой вероятностью у братьев будет хотя бы один общий гаплотип. При использовании 3-х STR локусов на каждую группу сцепления, популяционная частота любого гаплотипа будет существенно ниже 1%.

Для обоих подходов доступны мультиплексные флуоресцентные наборы. Если интересно - могу ответить в личной почте.

[someone]

Y-STR 656 неродственных мужчин из США

Согласитесь, некоторые могут иметь общего предка в последние 200-300 лет. В любой большой выборке должны быть совпадения, особенно вблизи частых гаплотипов. Но оценить % случайности без увеличения количества локусов невозможно в принципе, никакие опросы пробандов (родственники вы типа или нет) не помогут.

С другой стороны, если суммировать частоту мутаций локусов Yfiler получится вероятность хотя бы одной мутации - 5% на поколение. То есть в каждой 10-й паре сибсов будет хотя бы одна мутация.

На практике это бывает несколько реже, впрочем все равно укладывается в границы 1 мутация на 500-700 лет (= 20-28 поколений).


Думаю, идея насчет аутосом единственно правильная. Х-хромосома не помощница коли у них матери разные. 4 различия на мито даже у дальних кузенов я не встречал, больше одного уже казуистика и может быть только на С-трактах.

ЗЫ: Кстати, а отец этого мужика "К" - местный?

[someone]

Из сапплемента к статье Ревера 2008 по русским

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...792/table/Tab1/

[Gordiz]

Но оценить % случайности без увеличения количества локусов невозможно в принципе, никакие опросы пробандов (родственники вы типа или нет) не помогут....

Именно поэтому приводится ссылка на эту публикацию. По 37 Y-STR практически все эти Y хромосомы оказались разными, так что с формированием выборки у них все впорядке. Безусловно, близкие гаплотипы в недавнем историческом прошлом имели общего предка, поэтому слово "случайный" взято в кавычки, но с точки зрения экспертизы это врядли имеет значение.

Спасибо за ссылку на статью Ровера, для нас она, конечно, актуальней.

Думаю, идея насчет аутосом единственно правильная. Х-хромосома не помощница коли у них матери разные.

Если матери разные, отсутствие общих гаплотипов по X усилит на порядок гипотезу о том, что это не братья (родные братья должны получить хотя бы один общий гаплотип из 4-х групп сцепления с вероятностью 93,5%). Это тоже результат.

Могут ли родные братья иметь несколько мисматчей по мтДНК? Иногда наверное могут. Вот например, описанный случай гетероплазмии по двум эволюционно далеким гаплотипам. Результат получен в двух независимых лабораториях (включая лабораторию Вальтера Парсона), и ему нужно верить.


В свете этих данных другие сообщения об отцовском наследовании мтДНК уже не кажутся такими фантастическими.
Безусловно описанное явление встречается редко. Но насколько редко? Не известно. В большинстве лабораторий такой результат скорее всего игнорировали бы, предполагая контаминацию.

[Зубр]

Уважаемый 'someone'!

...ЗЫ: Кстати, а отец этого мужика "К" - местный?

"Б" приехал на сезонные работы. Такова уж специфика экспертной работы, что добыть подробные сведения о родственных связях можно только опосредованно - через следствие. Отсюда: информация зачастую не полная. В нашем рассматриваемом случае - братья "К" и "Б" (и, вероятно, их отец) из центральной части России (точно сейчас не могу сказать, но если надо посмотрю).
Уважаемый 'Gordiz'!

...Про мтДНК временами публикуют разные чудеса. Поэтому вероятность подвоха с этой стороны тоже не равна нулю...

Расшифруйте, пожалуйста, что за подвохи. Если нужно для обсуждения, готов привести таблицу сиквенсов.
Всем удачи.

[Gordiz]

Уважаемый 'Gordiz'!
Расшифруйте, пожалуйста, что за подвохи. Если нужно для обсуждения, готов привести таблицу сиквенсов.

Уважаемый Зубр!

Собственно я имел виду те данные, на которые сослался в предыдущем моем сообщении. Ведь если данные Y-STR мтДНК противоречат друг другу,имеет смысл рассмотреть возможную погрешность обоих методов.

Судя по статье, которую цитировал someone в базе данных yhrd.org довольно много данных по европейской части России, сделанных на Yfiler, и многие гаплотипы неуникальны. Интересно, принадлежат ли 16 общих локусов предполагаемых братьев какому-нибудь частому для России гаплотипу?

[someone]

Согласен с ув. Gordiz - для задачи дальнее родство не актуально. Особенно в свете дополнения ув. Зубра о том что семья не местная. Моя первоначальная логика была такая: в сельской местности вероятность близкородственной связи похожих гаплотипов выше общепопуляционной. Типа, найден похожий гаплотип - надо искать зацепку среди местных. Может среди родственников совпадающего мужчины. Конечно, сначала нужно определить частоту линии в общей популяции, хотя бы по тому же Реверу (он загнал эти данные в YHRD так что можно по быстрому).


Я думаю что разбор полета с мтднк может избавить от необходимости работать с Х хромосомой. Допустим доказали что матери разные - наверняка для следствия это будет железный аргумент, можно считать что проблема решена. Семья не местная, значит мы в ситуации "даны двое жителей России, вообще говоря из разных регионов, один русский, матери разные, отцы 16/17, оценить вероятность близкого родства по какой угодно линии". Допустим по YHRD мы оценили вероятность случайного совпадения в 3%. Вся другая информация, кроме У, только ухудшит эту оценку, ну допустим до 10% а то и больше.

Какие-либо возражения?

Если матери разные, отсутствие общих гаплотипов по X усилит на порядок гипотезу о том, что это не братья

допустим митолинии полученные от обоих индивидов известны в популяции, экспертиза аккуратная что не придраться, тогда зачем возиться с X?

Сообщение отредактировал someone - 22.02.2010 - 15:37