Выделение ДНК из потожировых следов

Добрый день уважаемые коллеги! Помогите с экспертизой, в виду малого опыта не знаю, как поступить: необходимо установить наличие крови и пота на ручке ножа (кровь визуально не видно), а затем выделить ДНК и типировать её. Вопрос, каким раствором необходимо делать смывы, что бы пока идет 18 часовая экстракция в холодильнике (или трехчасовая на столе) для установления наличия пота и крови, микро количество ДНК не было бы порушено ДНКазами? Может ТРИСОМ или буфером ТЕ, не повлияет ли это на установление наличия пота (нингидрин) или крови (бензидин и перекись)? Если у кого-то есть полная методика по работе с такими следами (при условии, что выделять либо фенольным способом, либо силикагелевыми частицами и форез только в ПААГ, ни анализатора, ни реал-тайма нет), поделитесь, пожалуйста, очень буду благодарен. Спасибо!

Здравствуйте!
В Вашем случае я бы сразу выделять начала (челексом, но ни в коем не фенольным методом), а в выводах написала бы не конкретно "пот" или "кровь", а "биологический материал". Зачем понапрасну тратить то, что возможно там (на ноже) есть. Кроме того установление наличия пота не даст Вам какой-либо информации о наличии ДНК. ДНК в поте выявляется за счет клеточных ядер, которые в нем могут содержаться в качестве примесей, а могут и не содержаться.

Спасибо большое за совет, попробую воспользоваться. Просто следователь спрашивает "есть ли пот, кровь?", переделывать вопросы не собирается, и заведущая настаивает делать наличие.

Ответственность за экспертизу несете по закону Вы, а не заведующая. Вам и определять, что первоочередно.

Да,это так,но прессинг со стороны зав.бывает.

Уважаемый 'Operon'!

Возьмите стерильный фрагмент марли, смочите буфером для протеиназы, например (или стерильной деионизованной водой), сделайте смыв с рукоятки ножа (возможно, два или более смывов - зависит от конфигурации ножа, загрязнённости и, вообще, внешнего вида). Разделите каждый из тампонов-смывов на 3 части (можно на 2, смотря как Вы ставите реакции наличия). Одну часть, ту что предназначена для получения ДНК, сразу поместите в эппендорф и на -20 градусов в морозильник. Две оставшиеся будут использованы для определения наличия крови и пота. Можно посмотреть клетки в микроскоп. Тампон из морозильника проводится через протеиназу К, фенол-хлороформ. Чтобы не потерять ДНК используется соосадитель. Осаждать ДНК лучше изопропанолом, осадок тщательно промыть этанолом. Можно выделять и силикой, а вот килекс в данном случае не годится, ибо конечный продукт в 200 мкл трудно сконцентрировать без потерь. Если крови и пота не обнаружится, а ДНК выделится и будет работать, то можно говорить о биологическом материале - для следствия это также важный результат. Это кратко.
Успехов.

Пробовал ли кто-либо использовать QIAguick PCR Purification Kit для очистки и концентрации днк фирмы промега? Интересны отзывы, а то лежат без дела, жалко. А использовать как-то страшно, вдруг что-нибудь не так пойдет.

Уважаемая 'Lady' !

Не бойтесь, пробуйте. Для избавления от ингибиторов ПЦР - милое дело. Потери ДНК минимальны, выход 90-95%. Правда, Promega не имеет к этому набору отношения, его производит QIAGEN.
Успехов.

Добрый день коллеги. Большое спасибо за помощь.
Зубр, а какой буфер используется для протеиназы? (у нас просто в дис. воде её разбавляют). Что значит соосадитель? (ацетата аммония имеется ввиду?) Изопропанола на данный момент нет, а в чем отличие в механизме действия его от этанола? (я слышал, что без разницы, единственное этанол берется 3:1, а изопропанол 1:1). Промывать необходимо обычным 70% этанолом из морозилки или есть еще этанол с 5М NaCI, какой лучше применять, в чем разница в механизме действия между ними?
За ранее спасибо.

Уважаемый 'Operon'!

Вы не будете развиваться, если не станете активно искать нужную информацию. Найдите в инете свойства протеиназы, условия ее оптимальной работы. Там обязательно будет описан буфер, я не говорю уже о статьях по судгенетике, где в каждой второй эта информация представлена. Кроме того, буфер для работы протеиназы к и буфер для хранения - не одно и то же.

Нет, ацетат, как и другие соли не являются соосадителями. Мы используем в качестве соосадителя дрожжевую транспортную РНК. Она заведомо свободна от ДНК, тем более ДНК человека.

Изопропанола достаточно взять 0.7 объема- это существенно, если хотите не превысить общий объем эппендорфовской пробирки. Промывать ДНК, а точнее отмывать ее как раз от солей, надо 70% этанолом из холодильника.
Удачи.

Здравствуйте, уважаемые Дамы и Господа! Привет из солнечной Одессы!
Интересует ответ на следующее категорическое мнение о том, что в следах пота (на впитывающих и не впитывающих поверхностях) при проведении судебно-цитологического исследования ядросодержащие клетки не могут быть обнаружены, вследствие отсутствия клеток в поте вообще. Однако, при этом, при приготовлении смывов из потожировых следов, обнаруженных на невпитывающих поверхностях, получить профиль ДНК при типировании с помощью "Identifiler +" удается в 30-50 % случаев.
Подскажите как объяснить данный феномен, может быть есть данные о сходной практике.
Заранее благодарен за помощь.

Уважаемый 'Odessit'!

С одной стороны, Вы сами отвечаете на свой вопрос. Следы пота содержат ДНК, которая может быть типирована. Клетки ли это? Ядра? Свободная от каких либо оболочек ДНК? Скорее всего, имеют место все эти события. Вопрос надо перевести в другую плоскость: зачем нужно искать клетки, если получен полный генотип? Что это даст? Надо понимать, что установленный генотип представляет собой истину более ценную, нежели установленные ядросодержащие клетки. Генотип однозначно означает: 1. Следы оставлены человеком. 2. Эти следы мужские (или же женские). 3. Следы оставлены конкретным лицом (решается вопрос идентификации при наличии образца сравнения). Единственная ценность цитологического исследования может состоять в установлении природы клеток, которые могут находиться как примесь к следам пота, то есть, это клетки крови, слюны (буккального эпителия) или еще какие-то клетки. Однако, эта задача кажется не реальной на сегодня.
Удачи.

Здравствуйте, уважаемые Дамы и Господа!
Отдельное спасибо Зубру за помощь!
Однако, речь идет о том, какой природы эти клетки (это важно!), если они не относятся к эпителиальным клеткам, клеткам выстилки потовых желез или другим, а человек оставивший следы не болен псориазом или т.п., и наличие их объяснить нельзя, значит это контаминация, т.е. в случаях получения ДНК-профиля в смывах со спусковых крючков, курков, скоб, гильз и др., результаты нельзя использовать в заключениях, в виду нарушения основной концепции нормальной физиологии, цитологии, судебной медицины.
Заранее благодарен за дискуссию!

Уважаемый 'Odessit'!

Категорически с Вами не согласен. Застывшие "концепции" надо ломать, и, прежде всего, мышление. Обнаруженная на "курках, скобах, гильзах" и т.д. ДНК, это ведь не конечный пункт и конечный вывод. Анализ показывает её количество, качество и, наконец, основные характеристики - генотип. Представьте себе картину: человек за которым на всём, к чему он прикасается остаётся шлейф биологического материала, клеток, полуклеток, обломков, ядер, экстрацеллюлярной ДНК наконец. И таков каждый из людей. Совершенствование методик позволило анализировать и эти следы в том числе. Безусловно, надо учитывать контаминацию, и не столько контаминацию лабораторную, где предпринимаются огромные усилия, чтобы её не допустить. Но контаминацию естественную (назову её так) - ведь кроме описанного выше мною человека, распространяющего вокруг себя сонм биологического мусора, по тем же местам раньше или после него прошли другие люди с такой же физиологией. Вот этих смешанных следов следует опасаться в большей степени. Ещё раз повторюсь, поиск клеток и установление их природы в ряде случаев крайне важны, в других случаях - просто важны, а в большой части случаев - не имеют принципиального значения.
удачи.

Уважаемый 'Odessit'!
Категорически с Вами не согласен. Застывшие "концепции" надо ломать, и, прежде всего, мышление. Обнаруженная на "курках, скобах, гильзах" и т.д. ДНК, это ведь не конечный пункт и конечный вывод. Анализ показывает её количество, качество и, наконец, основные характеристики - генотип. Представьте себе картину: человек за которым на всём, к чему он прикасается остаётся шлейф биологического материала, клеток, полуклеток, обломков, ядер, экстрацеллюлярной ДНК наконец. И таков каждый из людей. Совершенствование методик позволило анализировать и эти следы в том числе. Безусловно, надо учитывать контаминацию, и не столько контаминацию лабораторную, где предпринимаются огромные усилия, чтобы её не допустить. Но контаминацию естественную (назову её так) - ведь кроме описанного выше мною человека, распространяющего вокруг себя сонм биологического мусора, по тем же местам раньше или после него прошли другие люди с такой же физиологией. Вот этих смешанных следов следует опасаться в большей степени. Ещё раз повторюсь, поиск клеток и установление их природы в ряде случаев крайне важны, в других случаях - просто важны, а в большой части случаев - не имеют принципиального значения.
удачи.[/quote]
Здравствуйте уважаемые Дамы и Господа, уважаемый Зубр, спасибо за помощь! Догмы необходимо ломать, это факт, однако если эксперты-цитологи не видят (находят) клеток, а мы установили ДНК-профиль чего-то в смыве с....., в суде ушлый адвокат доказывает:"Нет клеток или не установлена их региональная принадлежность, наличие ДНК-профиля не подтверждает причастность данного индивидуума к определенному событию!!", на этом ВСЕ!
По-поводу "естественной" контаминации, нет ли у Вас сведений или работ, касающихся изучения факторов (длительности, температуры, поверхностей, общего состояния макроорганизма, психоэмоционального состояния и т.д.), влияющих на возможность образования биологических следов - шлейфов?
Заранее благодарен за помощь!

Здравствуйте, Odessit.
Предполагаю, что в описываемых Вами случаях могло произойти разрушение клеток и ядер под действием различных факторов, а вот сама ДНК, видимо, еще не успела распасться. По-моему, данная версия вполне имеет место быть.

Уважаемый 'Odessit'!

Абсурд! Именно ДНК индивидуализирует человека, являясь тем фактором, который сам по себе несет доказательную силу. Конкретная, индивидуальная ДНК неотъемлема от конкретного человека, а если и может быть отделена от этого человека, вместе со следами пота, мочи, крови, волосами - то она остается маркером данного лица, сохраняя каскад уникальных свойств. Согласитесь, что великолепный алмаз не потеряет ни одного карата, если его лишить сафьяновой коробочки. Конечно, только в последнее время, анализ ДНК стал на порядки весомее, чем он был на заре возникновения 'геномной дактилоскопии'. Отсюда и попытки "ушлых" адвокатов найти не существующие зацепки и противоречия в неоспоримых фактах. Ничего не остается, как отстаивать свою правоту, в том числе и в Суде.

Вопросы эти, конечно, изучаются, однако, физиология разных людей варьирует в широких границах. Попробую поискать литературу, такие факторы как поверхности и длительность - точно видел статью недавно, как найду - выложу на форуме.
Удачи.