Здравствуйте!
Цитата(zavlab @ 10.02.2016 - 16:45)
Здравствуйте. Впервые столкнулись с β-глюкуронидазой. приобрели сигмовскую из Escherichia coli тип IX-A G7396-25KU. Доставлена в термоконтейнере с холодовыми аккумуляторами, замороженная. Претензий нет. Развел в буфере 75 мМ фосфатном рН 6,8, Решил проверить, в паспорте субстрат для проверки- глюкуронид фенолфталеина, такого естественно нет. Взял пробу мочи с опиатами, 1 ч -кислотный гидролиз, 1 ч - ферментный, 1 ч -просто экстракция. Для простоты и наглядности использовал ТСХ. Результат- в кислотном отличный морфин, с глюкуронидазой следы, как в пробе без гидролиза.
Повторял с большей температурой, выдержку увеличивал до 4 часов, увеличивал количество фермента - результат нулевой. Вероятно фермент в мусор. Возможно на таможне разморозился, а фирма потом заморозила и нам привезла.
Глюкоуронидаза от Коли работает только в отношении глюкоуронидов, и никак не влияет на сульфаты.
Ферментативный гидролиз дело не быстрое и 1 часа явно недостаточно. У нас 2,5 тыс Ед на 0,5 мл мочи 2 часа при 45 гр. С. Посмотрите аннотации на продукт, обычно в Сигме указан стандартный подход.
Сколько грамм/Ед брали для пробы?