Выделение ДНК из гистологических срезов



Форум судебных медиков России > Судебная медицина и судебно-медицинская экспертиза > Судебно-медицинская генетика
MedGen
Здравствуйте. Очень нужна помощь. Проблема в следующем: имеются гистологические срезы, заключенные между предметным и покровным стеклами. Нужно выделить из этих срезов ДНК с целью выявления точковых мутаций (ПЦР, секвенирование). Кто-нибудь сталкивался с такой задачей? Как можно сделать это с минимальными потерями биологического материала? можно ли как-то оптимизировать под это дело протокол фенол-хлороформной экстракции и как лучше всего отделить стекла друг от друга и сам срез от стекла? unsure.gif


savskaya2
Здрасьте, здрасьте.
Сталкивались с этой задачей - исследования на корню задушили. Могу рассказать Вам про блоки - до стекол не дали мне дойти. Из блоков при обычной 48 - часовой формалиновой фиксации неплохо ДНК выделяется даже фенол-хлороформом и хорошие результаты дает ПЦР. Вопрос в том, сколько пролежало в формалине, в каком формалине и чем красили препараты на стеклах. В обычной гематоксилин-эозиновой окраске применяются сильные спирты и соляная кислота, так что многое зависит от того, какая окраска... Попробуйте найти блоки и взять кусочек в несколько кубических миллиметров. Стекла гистологические единственным способом друг от друга отделяют - погружают в раствор ксилола на неск. часов - и проверяют периодически растворился ли фиксатор (их несколько видов - природные и синтетический).


MedGen
Да из блоков я выделяю фенолом, дело в том, что кроме стекол от пациента больше ничего нет.
спасибо за совет, попробую с ксилолом. стеклам около 4 лет.


Зубр
Цитата(MedGen @ 31.07.2010 - 01:50)
Да из блоков я выделяю фенолом, дело в том, что кроме стекол от пациента больше ничего нет.
спасибо за совет, попробую с ксилолом. стеклам около 4 лет.

Уважаемый 'MedGen'!
Ксилол может оказаться бессильным, для того чтобы снять фиксирующий покровное стекло материал. Был случай: тупо колол покровное стекло стерильным скальпелем, поддевал осколки тем же скальпелем. Препарат (99%) остаётся на предметном стекле. Тут другая проблема, даже не одна. 1. загрязнение человеческим материалом, вносимое при приготовлении срезов (характерно для России, где нет полного цикла автоматизации: от фрагмента ткани до готового стекла). 2. толщина среза играет роль, из какого/каких органов и тканей срез. 3.Некоторые виды гистологических окрасок катастрофически влияют на ДНК, можно даже не пытаться такие окрашенные препараты генотипировать. Какая окраска у Вас в руках? Как Вы собираетесь выделять ДНК - как блоки стандартно, с октаном? Если говорить об очистке ДНК из уже полученного лизата, то я сторонник фенола с хлороформом. Критика этого классического метода часто связана с продвижением на рынок биотехнологических услуг различных наборов для получения ДНК. В Вашем случае, так как ДНК будет заведомо мало, необходимо добавить в раствор перед преципитацией какой-нибудь соосадитель. В целом, стёкла, пожалуй, один из самых проблемных объектов для ДНК-анализа.
Успехов.


MedGen
Зубр, спасибо за советы. у меня, если честно, тоже была такая мысль - соскоблить покровное стекло вместе с образцом и выделять из толченого стекла))) какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек. про загрязнение образца побочным человеческим материалом - мне кажется, в нашем случае это очень вероятно sad.gif хотя, если искать конкретную точковую мутацию, на сиквенсе она определяется, если она присутствует как минимум 20% ДНК-копий, если мне не изменяет мой склероз, конечно))))
будем пробовать разные варианты unsure.gif


Зубр
Цитата(MedGen @ 31.07.2010 - 11:42)
...какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек...

Уважаемый 'MedGen'!
Показав стёкла специалистам, можно определить и чем красили, и что красили. В крайности, можно хотя бы цветную фото внешнего вида (не под микроскопом) выложить с вопросом на ФСМ. Думаю, Вам помогут. Прикрепляю две статьи и ссылку по затронутой теме.
Успехов.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Нажмите для просмотра прикрепленного файла


MedGen
Зубр, спасибо Вам большое!!! smile.gif


Lady
Цитата(Зубр @ 31.07.2010 - 09:48)
Как Вы собираетесь выделять ДНК - как блоки стандартно, с октаном?


Можно узнать поподробнее что Вы имеете ввиду? Как получаете и очищаете лизат из блоков? Для чего нужен октан? Никогда с такой задачей ранее не сталкивалась, а, видимо, скоро предстоит.
Каким методом выделяете из фрагментов биоматериала, хранящихся в формалине?
Лучше ДНК получать из блоков или кусочков органов, извлеченных из гистологического формалинового архива (при условии, что они принадлежат одному лицу)?


Зубр
Доброго времени суток, уважаемая 'Lady'!
Цитата(Lady @ 26.10.2011 - 18:47)
Можно узнать поподробнее что Вы имеете ввиду? Как получаете и очищаете лизат из блоков? Для чего нужен октан? Никогда с такой задачей ранее не сталкивалась, а, видимо, скоро предстоит...

На форуме уже были прикреплены материалы (и остаются доступными) по выделению ДНК из гистологических препаратов. Это было год или два назад, то есть, давно, поэтому Вам простительно, что не нашли их. В качестве примера прикрепляю ещё два файла по очистке ДНК.
Цитата
...Каким методом выделяете из фрагментов биоматериала, хранящихся в формалине?...

Всё что погружено в формалин - очень быстро превращается в непригодный для ДНК анализа материал. Поэтому. чем меньше время экспозиции тканей в формалине, тем лучше. А выделять можно любым способом, какой Вам больше нравится.
Цитата
...Лучше ДНК получать из блоков или кусочков органов, извлеченных из гистологического формалинового архива (при условии, что они принадлежат одному лицу)?

Лучше из блоков.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Нажмите для просмотра прикрепленного файла


Наталья
Цитата
Всё что погружено в формалин - очень быстро превращается в непригодный для ДНК анализа материал.

Уважаемый Зубр! Если кусочки вырезают через 1-2, а то и 3 суток пребывания в формалине, они еще могут быть пригодны для ДНК анализа? А кусочки из сырого архива, хранящегося в баке с формалином в марлевом узелке среди десятков (сотен) таких же марлевых узелков от других трупов, уже непригодны, как я понимаю.


Зубр
Цитата(Наталья @ 27.10.2011 - 23:33)
Уважаемый Зубр! Если кусочки вырезают через 1-2, а то и 3 суток пребывания в формалине, они еще могут быть пригодны для ДНК анализа? А кусочки из сырого архива, хранящегося в баке с формалином в марлевом узелке среди десятков (сотен) таких же марлевых узелков от других трупов, уже непригодны, как я понимаю.

Да, уважаемая Наталья, почти что так. Деструкция ДНК в формалине приводит к невозможности применения тех методов, которыми она стандартно анализируется (не может работать ДНК-полимераза и др.ферменты). Поэтому, методические подходы к очистке ДНК из "формалинизированных" тканей сводятся к восстановлению структуры ДНК, в первую очередь.


Unior
Добрый, э-э-э, Здравствуйте!
Разрешите вставить и свои "пять копеек", одним словом, привет от гистологов!
Не знаю, известно ли вам сие, и как это может повлиять на ваши исследования, но думаю поделиться некоторыми секретами производства гистологических препаратов. Так вот, существует такое понятие, как "белкование стёкол", этим занимаются лаборанты и суть заключается в том, что берётся белок куриного яйца и наносится на предметное стекло с целью лучшего "прилипания" гистологического зреза. Выводы делайте сами. Существенно ли это для вас или нет, я не знаю, но информацию к размышлению дал.


someone
Куриная ДНК к счастью человеческими праймерами не берется.


alex-lab
Есть коммерческий набор, который разработан специально для выделения ДНК из фиксированных тканей



Доктор Немо
Цитата(MedGen @ 31.07.2010 - 12:42)
какая окраска и какие органы на срезах не ясно, т.к. стекла пришли из другого города без всяких сопровождающих бумажек.

Если Вам это важно - покажите стекла любому гистологу
Он сразу скажет, что это за орган и что это за окраска


Unior
Цитата(Доктор Немо @ 3.11.2011 - 21:31)
Если Вам это важно - покажите стекла любому гистологу. Он сразу скажет, что это за орган и что это за окраска

Подтверждаю! Любой гистолог просто почтёт за счастье заняться "угадайкой" во благо науки и торжества правосудия!


щепа
Цитата(someone @ 27.10.2011 - 23:19)
Куриная ДНК к счастью человеческими праймерами не берется.

Знаете в чем весь прикол, например, в нашей области вместо куриного белка для белкования используют обыкновенную человеческую отцентрифугированную сыворотку. Не факт.что у Вас делают не также. sad.gif


Unior
Ну, типа, сарказм. Я своего генетика только на собрании у начальника и вижу.


Gordiz
Цитата(щепа @ 3.11.2011 - 22:20)
Знаете в чем весь прикол, например, в нашей области вместо куриного белка для белкования используют обыкновенную человеческую отцентрифугированную сыворотку. Не факт.что у Вас делают не также. sad.gif

Это многое объясняет! Нам приходилось выделять ДНК из гистопрепаратов на стеклах. Часто, используя один фрагмент ткани получали смешанный генотип. В отделении патанатомии нам объяснили, что это связано с излюбленным методическим приемом гистологов: перед использованием стекла подышать на него и вытереть о рукав. Но мне всегда было непонятно, как можно столько надышать?


someone
Так вот оно в чем дело smile.gif


Зубр
Цитата(щепа @ 3.11.2011 - 22:20)
Знаете в чем весь прикол, например, в нашей области вместо куриного белка для белкования используют обыкновенную человеческую отцентрифугированную сыворотку. Не факт.что у Вас делают не также. sad.gif

Поэтому, в частности, стараюсь отказаться от анализа гистологических препаратов на стёклах. Там ещё с некоторыми видами окраски получить генотип проблемматично (о красителях на ФСМ уже была тема), а с учётом мизерного количества ткани настекле (читай-ДНК) "вытягивать" генотип и получить в результате смесь - то же самое, что бросая в воду камешки, не следить за кругами ими образуемыми, т.е. - пустое занятие smile.gif .


щепа
Цитата(Зубр @ 4.11.2011 - 10:23)
Поэтому, в частности, стараюсь отказаться от анализа гистологических препаратов на стёклах. Там ещё с некоторыми видами окраски получить генотип проблемматично (о красителях на ФСМ уже была тема), а с учётом мизерного количества ткани настекле (читай-ДНК) "вытягивать" генотип и получить в результате смесь - то же самое, что бросая в воду камешки, не следить за кругами ими образуемыми, т.е. - пустое занятие smile.gif .

я абсолютно с Вами согластна. Это.на мой взгляд,уж для совсем крайнего случая.


profgenik9a
Уважаемый Зубр. За свой недолгий век в генетике опять столкнулись с парафиновыми блоками. Прошлый раз все выделялось, что называется "методом научного и не очень тыка". Слава Уотсону и Крику, все получилось, но изначального субстрата было потрачено уйма. wacko.gif
В этот раз хотим воспользоваться протоколами, которые вы предложили, но одно не можем понять, что за реактив такой Tween 20 ? И где ж его достать ?


Зубр
Цитата(profgenik9a @ 19.02.2012 - 13:25)
Уважаемый Зубр. За свой недолгий век в генетике опять столкнулись с парафиновыми блоками. Прошлый раз все выделялось, что называется "методом научного и не очень тыка". Слава Уотсону и Крику, все получилось, но изначального субстрата было потрачено уйма. wacko.gif
В этот раз хотим воспользоваться протоколами, которые вы предложили, но одно не можем понять, что за реактив такой Tween 20 ? И где ж его достать ?

Доброго времени суток!
Информацию по tween20 прилагаю. Купить его можно в любой биохимической фирме, не только в Sigma, конечно. Как правило, на российском, да и многих других рынках, местные поставщики по названию сами найдут выгодные (для себя) условия покупки реагента. Так что нам, клиентам, останется только согласиться или отказаться от покупки.
Удачи.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла


profgenik9a
Благодарю.


Русская версия Invision Power Board © 2001-2017 Invision Power Services, Inc.

© 2002-2015 Форум судебных медиков
При копировании материалов сайта размещение активной ссылки на источник обязательно!