Трещины на срезах

Здравствуйте, уважаемые специалисты!

Это касается гистологии.

Пожалуйста, уделите мне немного своего драгоценного времени, объясните почему могут появляться подобные дефекты на срезах.

Проблема все время появляется на разных тканях.
Вот пример проводки. Она осуществлялась вручную.
Препараты печени, кусочки 10x5x1 мм
Фиксированы 48 часов 4% формальдегидом в фосфатно солевом буфере,
проводились 12 часов 70% EtOH,
2 смены по 1 часу 96% EtOH,
2 смены по 1 часу 99% EtOH,
Затем 3 смены абс. этанола по 1 часу,
две смены ксилола по 50 минут,
затем 4 часа в парафине низкоплавком при ~56С,
и 4 часа в нормальном при ~61С
и препараты заливались в блоки и резались на ротационном микротоме по 6 микрон. В итоге срезы расправляются нормально но под микроскопом на наклееных препаратах видно, что они имеют микроскопические складки. Окрашенные гематоксилин-эозином срезы демонстрируют множество микроскопических трещин. Сравнивались многоразовый нож, и сменные лезвия feather, в первом случае препараты иображены на картинке, а во втором, со сменными лезвиями, срезы вообще рассыпаются.
В прилагаемых картинках примеры данных срезов. Вероятно, это так называемое пересушивание? Т.е. я передерживаю в безводных растворителях? Я думал, что это тупой нож, но я брал новые сменные лезвия и все вообще крошилось.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Микроскладок не вижу,если они у Вас бывают,то это свидетельствует о том,что срез полностью не расправился,поскольку вода была прохладной.Расправлять срез нужно в тёплой воде.
Крошиться может из-за того,что пересушен или же в парафин,которым заливаете куски, не добавлен воск.


Так не делаем.Материал поступает фиксированным в 9-10% р-ре формалина.Затем,после вырезки заливается 10-12% раствором формалина и ставиться в термостат при 37-40гр.на 6 часов.

В первую очередь подумал бы о парафине . Жирные кислоты и церезин часто делают подобные проблемы.

Спасибо за ответы, господа!

Парафин использую Histomix, от компании Biovitrum

А остатки ксилола в образце не могут такую крошливость придать образцу?
Причем морфология ядер нормальная, видны ядрышки, а весь белок и клеточный, и внешний, весь расползается.

Я еще такой странный эффект наблюдал - если блок охлаждать льдом то видно что внутри от образца в парафине идут трещины.

Этого делать не надо.
Наши лаборанты помещают парафиновые блоки на колодках перед резкой в холодную воду.По одному достают и режут.Другой народ кладёт в холодильник на 30мин.,но не в морозилку.

Ксилолы хрупкости парафиновым композициям не придают.

Так не охлаждайте до нуля по цельсию. Парафины при низких температурах приобретают хрупкость (в зависимости от состава каждая смесь при разной температуре).

Может быть перепален парафин, или как было уже сказано воска либо нет, либо мало.
Охлаждать в минусах нельзя ни в коем случае.
И еще от себя: а почему Вы не используете хлороформ вместо ксилола при проводке? Ксилол намного токсичнее.

Наркоконтроль запретил в РФ применять хлороформ.
У нас с препаратами была проблема после перехода на ксилол.Не могли найти причину,потом наладилось.

Вот ето да. Можно подумать от этого наркетов стало меньше. Борьба как всегда не теми средствами и не в том месте. А как же здоровье работников? Хотя у нас в покраске тоже ксилол есть, но все-таки под вытяжкой... Кстати, уважаемые коллеги из РФ, как у Вас обстоят дела со спиртом? Мы от безвыходи (этил-прекурсор, перестали закупать) перешли на изопропиловый, однако в послежнее время с ним тоже перебои, и чем дальше, тем чаще. Может кто еще что-то подскажет? (Прошу прощения у ТС за использование темы)

Это проблема не парафина,а куска. Слишком много абсолютного спирта. Не нужно его вообще,по возможности! Он сильно пересушивает и сам кусок,еще не пропитанный парафином,трескается. А видно это становится лишь после пропитки парафином. А депарафинация какова?
Кстати, вместо хлороформы мы работали даже....на 98 бензине и ничего,приноровились. А изопреп-так это вообще прелесь что такое доя гистомикаса биовитрумовского)))

Абсолютный спирт это лабораторная экзотика. Вряд ли кто из СМЭ с ним работал...
Как один из вариантов ваше замечание верно , но сбрасывать со счета свойства парафина тоже не стоит. Хрупкость как следствие свойств парафина или температуры (переохлаждение парафина) тоже имеет место быть.

Конечно же,хрупкость парафина-немаловажный фактор. Просто я сама работаю на биовитрумовском Гистамиксе,он из всех готовых парафиновых смесей наиболее пластичен. Хотя,если честоно,мне нравилось по-старинке просто парафин перетапливать с долей пчелинного воска. Лучше всяких смесей!

Таким образом продолжают делать у нас.

А у нас почему-то не могут найти,где закупать простой парафин. А из старых блоков мы уже дважды переплавляли....

Если надо,узнаю.
Продаётся в мешках,кажется с надписью "Лукойл".

Такое может бывать при неверном угле наклона ножа . Попробуйте поменять его-плюс-минут от обычного на 1 градус. И как говорилось выше-возможно погрешности проводки. Мы у себя не используем абсолютный спирт. Пишу вариант нашей проводки без фиксации:
1 спирт 70-2 часа,2 ой спирт 96-6 часов,3 ий спирт 96- 8 часов. Хлороформ - две смены по три часа, затем смесь парафина и хлороформа 1:1 не менее полутора часов, затем три смены парафина по 30 минут. После этого заливка материала смесью парафин-воска. . Если работаем на Гистомиксе-то вместо трех смен парафина материал проводим по двум сменам гистомикса. Режем охлажденные блоки. Но я пробовала-нормально режутся и неохлажденные. Может вам пригодится эта схема. Мы на ней работаем много лет. Удачи!

Будьте добры,узнайте,пожалуйста!

Заказывают через интернет.
"Славнефть","Лукойл".
Фирмы везут парафин своим транспортом.

Спасибо большое! Как выйду из отпуска,обзвоню их. А ведь "Славнефть" вообще Ярославская,по-моему, компания?

Не знаю.