Получение ДНК из костей

Уважаемые коллеги!
Открываю раздел по методическим подходам экстракции геномной ДНК из костной ткани. Тема становится всё более актуальной. Вывешу для начала интересные исследования в данной области.

Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Нажмите для просмотра прикрепленного файла
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Здравствуйте. Подскажите, проводите ли вы декальцинацию костного материала перед выделением ДНК, и какой способ предпочитаете?

Уважаемый 'Хонки-Тонки'!
У нас в отделении отработана методика получения ДНК из костной ткани с длительной (78 часов и более) декальцификацией. Поначалу пробовали и без декальцификации делать, но столкнулись со следующей проблемой: нестабильность конечного результата (то получается пригодная к амплификации ДНК, то не получается). Пришли к выводу, что декальцификация вносит определённый элемент стабильности в получаемый результат. "Проходим" почти все кости, которые к нам поступают. Для кости средней сохранности - нужно около 5г порошка. Трубчатые кости лучше получаются, чем кости черепа, лопатки и позвонки. Но иногда, удивительно хорошо ведут себя кости стопы и кисти.
Всего наилучшего.

Спасибо. Попробуем применить и мы. Ситуация, когда приблизительно в половине случаев по материалам, связанным с исследованием костных останков, результаты либо отрицательные либо труднотрактуемые, не очень устраивает.

Здравствуйте, уважаемый зубр.
Меня интересует вопрос подготовки костей к выделению. Отделяете ли вы остатки мышечной ткани, и обрабатываете ли вы кости перекисью? Поделитесь, пожалуйста, опытом. Стоит ли проводить декальцификацию в случаях с гнилыми костями?
Каким набором праймеров вы пользуетесь при анализе костной ДНК?

Уважаемый 'ramail'!
От мышечной ткани стараемся избавиться полностью, как и от костного мозга внутри трубчатых костей. Другое дело, когда фрагменты высохших мышц обнаруживаются на внешней поверхности кости. Тогда параллельно выделяем ДНК из кусочков снятых с кости мышечной ткани, иногда мышца срабатывает и получение ДНК из костной ткани отменяется. Перекисью не обрабатываем. Дистиллированная вода и этиловый спирт. Как уже писал - декальцификацию проводим всегда, с любыми костями.
Успехов.
Да, ещё про наборы. STRы производства АТГ "Биотех", Москва, Applied Biosystems (Identifiler, Y-filer). Могут применяться и другие - главное пробоподготовка!

Большое спасибо за столь быстрый ответ.
Однако нельзя ли по подробней про спирт и дистиллированную воду (процентность и время)?

Первый этап. Выбор кости из которой будет произведён выпил (или места на кости) и реализация последнего.
Второй этап. Очистка фрагмента кости снаружи и внутри (если трубчатая). Всё под струёй воды в раковине.
Третий этап. Последовательное погружение на несколько минут в каждый раствор фрагмента в дист воду - спирт 96 - дист воду.
Четвёртый этап. Высушивание на воздухе 12 часов.
Пятый этап. Дробление кости в ступке из металла (сталь нерж, бронза) до состояния мелких опилок, но не муки.
Шестой этап. Декальцификация и так далее...

Вы говорите, кости надо перемалывать до стружки? А чем плох порошок?

Порошок плохо оседает при декальцификации, даже при центрифугировании. Кроме того, для того, чтобы добиться состояния порошка, надо либо использовать особые мельницы с охлаждением, либо пилить, что приводит к избыточному нагреванию материала. Удобнее работать с мелкими опилками. Позже приведу фотографию.

А скажите, пожалуйста, в какой пропорции заливаете лиз. буфер. И на какое время. В одной из статей, предлагаемых Вами, есть методика, по которой кости выдерживают в лиз. буфере почти неделю. Как время сказывается на структуру и стабильность костной ДНК? Существует ли риск передержать костный порощок в лиз.буфере?

Уважаемый 'ramail', в лизирующем буфере материалу кости находиться надо 18-24 часа, но не более 24. Эффективность работы протеиназы катастрофически падает после нескольких часов работы, а выходящие в раствор нуклеазы - не дремлют Поэтому, если опилки после ночи лизиса на 80% растворились, то лучше взять этот раствор для дальнейшей работы (на всякий случай заморозив оставшийся нелизированным материал).
Успехов.

Доброго времени суток уважаемые форумчане!
Как обещал, привожу фото.

Начальный этап - выпил кольца трубчатой кости.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Получено примерно 2 г опилок.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

На следующем кадре стрелками отмечены типичные фрагментики.
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Всем привет.

Уважаемые судебные медики!
Много лет работал с Вами и высоко ценю Ваши знания и опыт.
Сейчас, находясь на пенсии и проживая в государстве Израиль, стал использовать свои навыки в розыске пропавших без вести солдат. За это кстати, предусмотрена солидная денежная премия.
Путем тщательного расследования и оперативного и следственных действий в предполагаемом мною месте я нашел фрагмент кости. Этот фрагмент я сдал в установленном порядке в полицию, откуда это было отправлено на экспертизу. Был получен ответ, что это действительно кость человека, но определить ДНК или не смогли или не захотели отписавшись, что по данному фрагменту определить ДНК не представилось возможным. Хотя фрагмент представляет собой половину трубчатой кости левого предплечья размером около 9 см в длину и около 3 см в ширину - фото имеется. В кости даже сохранилось мозговое вещество, а сверху визуально видны остатки ткани, что я и опытный врач определили как срок от 4 до 8 лет нахождения в земле. Поэтому у меня большие сомнения, что ответ местной экспертизы верен.
Если кто-то сочтет уместным ответить снисходительно на мое невежество буду крайне признателен.
С уважением Виктор Нарыжный, опер на пенсии, писатель

Уважаемый 'Викто',
Сначала этот фрагмент надо увидеть, потом попробовать получить препарат ДНК и оценить пригодна ли полученная ДНК для генетического анализа. К сожалению, эмпирически на Ваш вопрос ответить невозможно.
Успехов

Уважаемый господин Зубр!
В таком случае может ли быть полезной качественная фотография?
На всякий случай попытаюсь прикрепить таковую к сообщению.
Большое спасибо за ответ.

Здравствуйте Зубр!

"Несколько минут" - это в цифрах сколько?
И еще скажите, пожалуйста, чем Вы производите выпил кости? Я имею ввиду инструменты.

Уважаемый 'Викто',
Внешний вид кости даёт основания для начала работы по получению препарата ДНК. Это не значит, что успех гарантирован, но это означает, что рационально будет попробовать установить генотип данного фрагмента кости.
Удачи.

Доброго времени суток!

Уважаемая 'Lady',
Это приблизительно 2-3 минуты. В спирте можно подержать и подольше. Пилить удобнее ножовкой с не очень маленькими зубьями (ножовка по металлу, например) и не очень большими (пила по дереву). Электроинструментом не пользуемся.
Удачи.

Добрый день коллеги. Уважаемый Зубр, а почему бы Вам, основываясь на опыте, не написать методику по выделению ДНК из костей, с четким описанием всех этапов, какие применяются буферы, как готовятся, хоть и понятно, что к каждой кости свой подход, но хотя бы от чего можно оттолкнуться. Я пробовал и так и эдак, не нашел четкого подхода, и почему то часто с декальцинацией вообще ничего не получалось, а без - получалось (с одним и тем же материалом), может ингибиция, может разрушение, может потеря, не знаю, реал-тайма у нас нет, делаем все в слепую. Опишите хотя бы как Вы проводите декальцинацию и лизис. На самом же деле кости - это огромная проблема и надо с ней бороться. За ранее спасибо.

Уважаемый 'Викто',
Внешний вид кости даёт основания для начала работы по получению препарата ДНК. Это не значит, что успех гарантирован, но это означает, что рационально будет попробовать установить генотип данного фрагмента кости.
Удачи.

Доброго времени суток!

Уважаемый Зубр!
Очень меня порадовал Ваш ответ, который подтверждает мое непрофессиональное мнение.
Следовательно, можно предположить, что местная лаборатория или неквалифицированна
или получила свыше команду на такой ответ, который блокирует меня.
Будьте так любезны - подскажите мне пожалуйста - Вы наверное знаете или сами возглавляете
учреждение, которое способно провести нужную экспертизу и установить не только ДНК, но и
совпадение с родственниками - отцом, матерью или братом. Образцы ногтей имеются.
Разумеется, я отдал в местное отделение лишь часть фрагмента.
На прилагаемых фото видно, как я делил данный фрагмент.
Заранее признателен за ответ.
С уважением ВикторНажмите для просмотра прикрепленного файла Нажмите для просмотра прикрепленного файла

Здравствуйте!
Возможно ли выделить ДНК из обгоревших костей (пожар в зимовье, есть кости черепа, зубы и позвонки) и установить совпадение с родственником (матерью)?

Возможно, если в позвонках остался спинной мозг (выделяла фенолом, ДНК целое ведро).
Зубы можно, но лезет много лишнего.
Надо поработать ...

Уважаемый Пыхтачек, спинного мозга в позвонках не осталось.
Что значит, "лезет много лишнего"?
Над чем поработать?

Уважаемый 'Пастух'!

Кости могут обгореть в разной степени. Есть варианты, когда генетике делать уже нечего. Иногда, ДНК получается из обгоревших костей даже лучше, чем из всякого рода других костей. В каждом конкретном случае надо смотреть на материал, и смотреть должен профессионал. Профессионал не выделяет ДНК ведрами, у него не может полезть много лишнего, и вообще, профессионал будет аккуратен в высказываниях. Теперь Вам осталось только его найти...
Удачи.

Уважаемый 'Пастух'! много лишнего-"лэддер"-эффект,
не видя костей, нельзя сказать над чем работать, уверена, рядом с вами есть профессионалы, которые посоветуют выбрать наиболее перспективный объект. Мой пример не очень удачен, но это единственный положительный случай с обгоревшими костными останками...

Уважаемый ЗУБР! Сленг - понятие условное и довольно специфично и нет необходимости подменять его понятием непрофессионализма.

Спасибо, уважаемый Зубр!
По ситуации: 20.09.2011 года сгорело зимовье в тайге Тындинского района. Три человека выскочило, один нет. Следователь при ОМП изъял часть останков. Далее мать погибшего своими силами собирала оставшиеся останки. Останки приобщены к материалам проверки. Со слов матери (материалы которые у нее есть принесет сегодня) проводилось исследование, но только на предмет соответствия изъятых следователем останков и принесенных матерью.
УД не возбуждено. Отказ в ВУД - небрежное обращение с огнем.
Скорее всего я возьмусь за это дело.
В случае возбуждения уголовного дела, буду ходатайствовать о проведении экспертизы.
Куда Вы посоветуете обратиться?
Спасибо!

Важно же не расстояние, а качество. Полагаю, что РЦ СМЭ...

Спасибо!
Не получилось фото выложить в криминалистике, попробую здесь
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

это сгоревшее зимовье

это костные останки
Нажмите для просмотра прикрепленного файла

вот еще
как же так? при температуре горения 600 градусов примерно, утеплитель даже не оплавился
Нажмите для просмотра прикрепленного файлаНажмите для просмотра прикрепленного файла

И не их количестве Со слов матери (материалы которые у нее есть принесет сегодня)

Наверно материал уже видели ? Что скажете, очень интересно. По фоткам вроде ребра целы, а они при белом калении наверно первые рассыпаются в прах......
А зубы как ? ДНК выделили ?

В данном случае ДНК может сохраниться только в зубах. Хотя, надо попробовать на ощупь кости. Если легко крошатся, то и зубы не помогут. Удачи.

При СМ исследовании, "кости крошатся при надавливании...."

Тогда точно надежда только на зубы, хотя вероятность стремится к 0.

Добрый день.
Вопрос к уважаемому Зубру

Почему Вы отказались от обработки перекисью? в чем смысл обработки этиловым спиртом?
Я полагал что обработка перекисью преследует две цели: во-первых (и главная) избавиться от возможной поверхностной контаминацией чужеродной ДНК, во-вторых уничтожение микроорганизмов со всем энзиматическим багажом (на мой взгляд задача второстепенная если не надуманная). Но в чем смысл и задача обработки этиловым спиртом не представляю, просветите пожалуйста, вероятно я чего-то не понимаю.
Вопрос непраздный, мне приходится работать с фрагментами костей свода черепа. Черепа коллекционные а значит когда-то вываренные, матриксной ткани мало и меня здорово смущает воздействие на ДНК объекта в губчатой ткани находящейся между двумя тонкими слоями матриксной кости.
Предотвращая заранее вопросы скажу что выделяю с помощью ВТА-лизиса о последующей отмывки на магнитных частицах.

Добрый вечер
спасибо уважаемому Зубру за оперативный ответ.
Насчет наработок говорить еще рано, сделано два черепа, сроки хранения посмотрю завтра. Костный материал был взят из свода черепа, вначале пытался использовать выпилы из нижней челюсти но два раза из первой кости получил смесь профилей, прежде чем отказываться от исследования взял еще материал из свода и получил хорошие данные. Второй череп сразу брал из свода черепа. В Обоих случаях имелись образцы по одному из ближайших родственников, профиль получен полный и совпадение с образцами по аллелям как по учебнику.
Сегодня взят в работу еще один череп, местные криминалисты пугают 105 черепами накопленными за последний десяток лет. Надеюсь материалов для анализа хватит - тогда и можно будет всерьез обсуждать что это - случайная удача или что-то стоящее.
Насчет обезжиривания кости этанолом - как я сам не додумался об этом! Два раза уже сталкивался с ситуацией когда после перемалывания на мельнице Retsch получалась не костная мука а какое-то "песочное тесто" (один объект была бедренная кость, другой нижняя челюсть). Правду сказать: для материала из бедренной кости все закончилось благополучно.
С уважением и наилучшими пожеланиями

Добрый вечер
отвечаю на вопрос уважаемого Зубра, один череп 2006г., второй 2009. сейчас в работе 2011
с наилучшими пожеланиями и удачи

Уважаемый Зубр! помогает ли этиловый спирт, если из костей жир буквально сочится?
Однажды сушила такую кость около 10 дней, постоянно меняя фильтровальную бумагу, в которую кость была завернута. ДНК была выделена только после полного высушивания кости, т.е., когда стало возможным перемолоть кость в порошок. До этого момента ничего не получалось.
Этиловый спирт растворяет только поверхностный жир на костях?

Господа и дамы СМЭ, проблема выделения ДНК из трудных
объектов, включая кости, зубы, смесь крови с землей и др.,
была решена 2 года назад фирмой Boreal Genomics.
http://www.borealgenomics.com/aurora/system/

Уважаемый 'smex'!

Спасибо за информацию. Вы сами используете эту технологию? Вы её рекомендуете, значит должны хорошо знать в чём она заключается. Расскажите об этом кратко. Сама фирма пишет о принципах работы своего комплекса весьма туманно. Кстати, судебная генетика для фирмы borealgenomics - это тоненькая веточка её интересов.
С наилучшими пожеланиями.


Вам нужен фрагмент кости весом около 5 грамм. Промойте этот фрагмент проточной горячей водой, а потом на недолго (5 мин) в спирт. Жиру неоткуда будет браться.
Успехов.

Принцип этой технологии, вкратце, старинный (описан у Маниастиса) -
электрофорез. Отрицательно заряженная ДНК бежит известно куда.

Цель моего замечания была святая - чтобы господа и дамы СМЭ иногда
выглядывали из своих окопов и смотрели на мир во всем многообразии
и мечтали о чем-нибудь прекрасном, а не только о спиртовых примочках.

Про "тоненькую веточку её интересов" - очень поэтично. Браво.

работал с утеплителем на даче.он практически не горит.при высоких температурах распадается на порошок. кости на вид пригодны.

а подходит ли этот способ для костей и зубов эксгумированого трупа 2001года и можно ли достоверно из таких обьектов установить ДНК?

Здравствуйте! Обращаюсь к специалистам, которые смогут помочь. Возможно ли извлечь какую-то информацию из кости, которая пролежала 30 лет в земле? И где в Москве можно это сделать?
Спасибо за помощь!

Уважаемый Зубр, а чем проводите декальцификацию? ЭДТА?
Если да, то проводите ли замену раствора ЭДТА и как часто?

Да, ЭДТА. Количество смен зависит от состояния кости, от него же зависит и количество опилок. В среднем, 2г кости нуждаются в трёх сменах по 12 часов.
Удачи.

А не подскажите ли по поводу конкретных областей на костях с которыми лучше работать - допустим вот у Вас "хорошая" бедренная кость - с чем бы Вы работали? С самой костью (диафизом) или например с головкой (эпифизом)? На какие области вообще лучше обращать внимания на костях - на те, в которых заведомо должно быть меньше кальция? Поясните пожалуйста.